Mehanizmi ohranjanja nukleotidnega zaporedja DNA. Popravilo

Pod vplivom alkilirnih sredstev, na primer N-metil-TG-nitrozosečnine ali N-metil-nitrozosečnine ali N-metil-nitrozogvanidina, nastanejo v DNA O 6 -metil - ali O 6 -alkil substituirani gvaninski ostanki. Tako modificirane ostanke gvanina je mogoče dealkilirati s sodelovanjem encimov, prisotnih v bakterijskih in sesalskih celicah. O 6-metilgvanin DNA alkiltransferaza katalizira prenos alkilnih skupin v sulfhidrilne skupine cisteinskih ostankov encima in akceptorski protein je inaktiviran. Vsebnost alkiltransferaze v celicah E. coli se poveča v prisotnosti O 6 -alkilgvanina, vendar podobne inducibilnosti ni opaziti v celicah sesalcev.

Ko je DNK obsevana z ultravijolično svetlobo, tvori ciklobutanske dimerje med sosednjimi pirimidinskimi bazami. Takšne spojine blokirajo replikacijo DNA in jih je treba odstraniti, da se ohrani sposobnost preživetja celic. Eden od načinov za odstranitev pirimidinskih dimerjev je njihova encimska pretvorba v monomere z osvetlitvijo raztopine z vidno svetlobo v območju valovnih dolžin 300-600 nm. Takšni fotoreaktivacijski encimi so prisotni v bakterijah in nižjih evkariontskih organizmih, vendar jih v celicah sesalcev ni. Encim tvori stabilen kompleks s pirimidinskim dimerom in z uporabo energije svetlobe, ki jo absorbira, uniči dimer, ne da bi pretrgal verige DNA.

b. Popravilo z zamenjavo modificiranih ostankov

Zamenjava spremenjenega nukleotida običajno poteka v štirih korakih. Prvič, encim prepozna ta nukleotid in prereže polinukleotidno verigo blizu njega ali prekine glikozidno vez med modificirano bazo in deoksiribozo. Drugič, eksonukleaza odstrani modificiran nukleotid in/ali sosednje nukleotide, pri čemer ostane majhna vrzel. Tretjič, izbrisana regija se na novo sintetizira iz konca 3-OH z uporabo nasprotne verige kot predloge. Četrtič, konci prekinitve, ki nastanejo kot posledica popravila, se združijo, da se obnovi kovalentna celovitost popravljene niti.

Mesta, kjer je prišlo do depurinacije ali depirimidinizacije, cepijo encimi, imenovani AP endonukleaze. V pro- in evkarijanskih celicah je veliko različnih endonukleaz AP, pogosto več različnih vrst. Nekatere endonukleaze AP prerežejo verigo s 3" strani mesta AP, druge pa cepijo diestersko vez s 3" strani; v vsakem primeru nastaneta 3"-hidroksilni in 5"-fosforilni konec. Prekinitev fosfodiestrske vezi na eni ali drugi strani prekinitvenega mesta omogoči eksonukleazi, da odstrani sosednje ostanke na obeh straneh mesta cepitve in nato ponovno sintetizira izbrisano zaporedje.

Pri popravljanju N-alkiliranih purinov in drugih modificiranih baz imajo ključno vlogo specifične N-glikozilaze – encimi, ki cepijo glikozidno vez med modificiranimi bazami in deoksiribozo. N-glikozilaze se uporabljajo tudi pri korekciji motenj, ki so sestavljene iz spontane deaminacije citozina ali adenina in njihove pretvorbe v uracil oziroma hipoksantin. Encima uracil glikozilaza in hipoksantin glikozilaza odcepita uracil oziroma hipoksantin iz DNK, pri čemer na mestu cepitve ostanejo vrzeli. In spet, z uporabo mehanizma cepitve-resinteze, se prvotno zaporedje poškodovane verige obnovi.

Uracil glikozilaza ima tudi zelo pomembno antimutageno vlogo pri odpravljanju napak, ki nastanejo, ko se med replikacijo uporablja dUTP namesto dTTP. Ker se dUMP pari s predlogo skoraj tako dobro kot dTMP, ga Pol III ne prepozna, in če dUMP ni posebej izrezan, se lahko dGMP vključi v novo verigo med naslednjim krogom replikacije. Tako g-glikozilaza ščiti celice pred možnimi mutagenimi posledicami vključitve dUMP v verigo DNA.

Popravilo dimerjev timina lahko poteka tudi v temi na enega od naslednjih dveh načinov. V celicah E. coli se sintetizirajo trije polipeptidi, kodirani z geni uvrA, uvrB in uvrC, ki tvorijo encimski kompleks uvrLBC-endonukleaza. Ta encim prereže verigo DNK, ki vsebuje pirimidinski dimer na razdalji osmih fosfodiestrskih vezi na 5" strani in štirih ali petih vezi na 3" strani pirimidinskega dimera. Zdi se, da odstranitev poškodovane regije katalizira helikaza, ki jo kodira drug gen, uvrD. To odstrani dimer timina in približno 12 drugih nukleotidov, ki ga obdajajo. Nastala vrzel se zapolni s pomočjo Pol I, DNA ligaza pa dokonča popravilo tako, da združi dve sosednji bazi verige. Nekateri organizmi uporabljajo drugačen mehanizem za popravilo škode, ki jo povzroči tvorba pirimidinskih dimerjev. Popravilo poteka s sodelovanjem pirimidin dimer-g-glikozilaze, ki ustvari apirimidinsko mesto. Glikozidna vez med enim od timinov in deoksiribozo se prekine, tako da dimer timina ostane na 5" koncu pretrgane verige, skupina 3"-OH pa ostane na deoksiribozi. Nastali 3"-AP konec se odcepi z uporabo 3"-5" eksonukleazne aktivnosti DNA polimeraze, nato pa se z nick translacijo in ligacijo odstrani nukleotid skupaj s sosednjim dimerjem timina, nastala vrzel se zapolni in konci verige so zašiti.

V. Pomen popravljanja DNK

V procesu evolucije so celice razvile kompleksen mehanizem za odpravo poškodb, ki nastanejo v DNK pod vplivom najrazličnejših kemičnih in fizikalnih dejavnikov, pa tudi zaradi napak pri replikaciji ali rekombinaciji. In to je povsem razumljivo: večina poškodb blokira prenos genetskih informacij na naslednjo generacijo, preostanek pa bo, če ne bo odpravljen, ostal v genomih potomcev in povzročil dramatične spremembe v beljakovinskih molekulah, vključno z encimi, potrebnimi za vzdrževanje življenje celice. Ko so nekateri deli popravljalnega sistema poškodovani, postanejo celice še posebej ranljive za nekatere kemične in fizikalne dejavnike. Tako so na primer celice E. coli, ki imajo porušen sistem vnašanja prelomov v DNK pri cepljenju dimerov timina, zelo občutljive na UV svetlobo. Celice, ki ne morejo izvesti ene ali druge N-glikozilazne reakcije, so veliko bolj dovzetne kot normalne celice za mutagene ali smrtonosne učinke alkilirnih sredstev ali ionizirajočega sevanja. Celice E. coli s pomanjkanjem Pol I so znatno zmanjšale preživetje pri obsevanju z nizkimi odmerki UV svetlobe.

Nižji evkariont Saccharomyces cerevisiae ima vsaj pet genov, ki kodirajo proteine, ki sodelujejo pri uvajanju prelomov v UV-obsevani DNA. Motnja v samo enem od teh petih genov RAD povzroči, da celice izgubijo sposobnost uvajanja prelomov DNK in s tem odstranitve pirimidinskih dimerjev. Pri kvasovkah obstajajo tudi mutanti z oslabljeno zmožnostjo odstranjevanja navzkrižnih povezav med verigami, čeprav se eliminacija UV-povzročene poškodbe odvija normalno. To nakazuje, da ima kvas, tako kot ljudje, posebne, zelo zapletene popravljalne mehanizme za odstranjevanje navzkrižnih povezav in morda tudi za popravljanje številnih drugih kemičnih sprememb v DNK.

Ljudje s pigmentno kserodermo so zelo občutljivi na ultravijolično svetlobo in razvijejo različne oblike kožnega raka že pri zelo majhni izpostavljenosti sončni svetlobi. Celice takšnih ljudi nosijo mutacijo, podobno mutaciji RAD pri kvasovkah, in se kažejo v tem, da imajo oslabljeno sposobnost cepitve pirimidinskih dimerov iz UV-obsevane DNA. Bolezen lahko povzroči mutacija v enem od vsaj devetih genov, kar nakazuje na precej zapleten mehanizem popravljanja DNK, ki vsebuje dimerje timina pri ljudeh. Praviloma je bolezen povezana z nezmožnostjo sproščanja dimerjev timina. Če obsevanim celicam v kulturi dodamo encim z aktivnostmi timin dimer glikozilaze in AP endonukleaze, lahko UV-poškodbe odpravimo.

Skupna informacija

Kot je razloženo v 6. poglavju, celične membrane v normalnih pogojih opravljajo številne funkcije. Plazemske in znotrajcelične membrane bodisi delujejo neodvisno - predvsem zaradi integralnih proteinov, ki se nahajajo na obeh straneh membrane, bodisi sodelujejo pri celičnih funkcijah, povezanih z njimi (zaradi nadzora s strani receptorjev in transportnih proteinov), pa tudi v funkcijah strukturnih celic. sestavine celice, sestavljene iz drugih beljakovin, lipidov, sladkorjev in mikroelementov.

Na splošno poškodbe celice spremljajo motnje v genetskih, biokemičnih in fizikalno-kemijskih procesih, ki se pojavljajo v njej, in so povezane s transformacijami makro- in mikromolekul, vključno s: polinukleotidi in nukleotidi, polipeptidi in peptidi, polisaharidi in monosaharidi, lipidi in njihove komponente ( fosfolipidi, sfingolipidi, maščobne kisline, holesterol), kot tudi gibanje kovinskih ionov in drugih kemičnih spojin, prostih radikalov, elektronov, atomskih in atmolarnih struktur.

Zato so zaščitni in obnovitveni (popravljalni) encimski sistemi tako pomembni za celico v primeru različnih vrst poškodb. Oglejmo si te sisteme ob upoštevanju podatkov o strukturni organizaciji, vzrokih in mehanizmih poškodb celic, predstavljenih v prejšnjih poglavjih priročnika, ter podatkov o glavnih oblikah celične smrti.

ZAŠČITNO IN OBNOVILNO

ENCIMSKI SISTEMI ORGANIZMA

Kot veste, so glavni zaščitni in regenerativni sistemi telesa živčni, endokrini in imunski sistem (glejte poglavja 13-15). Nato (po pomembnosti) pridejo na vrsto razstrupljevalni sistemi notranjih organov (jetra, vranica, ledvice),

tkiva (koža in sluznice) in končno celični zaščitni in regenerativni sistemi, vključno s sistemi citokroma P 450, od glutationa odvisnimi encimi, superoksid dismutazo (SOD), katalazo, plazmalogeni, peroksidazami in fosfolipazami (zlasti fosfolipidi) in drugimi sistemi povezana z obnovo strukturotvornih komponent celice. Posebno pozornost si zaslužijo številni sistemi popravljanja DNK in še vedno malo raziskani encimski zaščitni sistemi bioloških tekočin v telesu (kri, limfa, možganska tekočina, želodčni in črevesni sok). Vsi ti zaščitni in regenerativni sistemi telesa temeljijo na delovanju genov, združenih v eno samo gensko mrežo (glej 2. poglavje).

Najprej si poglejmo najbolj znane celične obrambne sisteme.

Ksenobiotični razstrupljevalni sistemi

Sisteme inaktivacije (razstrupljanja) telesu tujih snovi ali ksenobiotikov nadzirajo okoljski geni, ki kodirajo sintezo številnih encimskih proteinov, ki presnavljajo (razgrajujejo in razstrupljajo) in odstranjujejo ksenobiotike iz telesa.

Mutacije v genih za razstrupljanje pogosto povzročijo dedno nagnjenost k resnim boleznim, ki prizadenejo različne telesne sisteme in posamezne organe. Na primer, povezava med kliničnimi manifestacijami cistične fibroze, ki jo povzroča velika mutacija (CFTR), in stanjem genov sistema za razstrupljanje je bila dobro raziskana. Glavne manifestacije te bolezni so huda kronična obstruktivna pljučnica, ki vodi do prezgodnje smrti bolnih otrok, ki praviloma ne dočakajo dvajset let. Po drugi strani pa mutacije v samih genih za razstrupljanje pogosto povzročajo nagnjenost k razvoju pljučnih bolezni: bronhialne astme, kroničnega obstruktivnega bronhitisa, raka, emfizema in drugih pljučnih patologij.

Predlagano je bilo tudi, da lahko alelne različice genov za razstrupljanje vplivajo na klinične manifestacije pri cistični fibrozi. Ta predpostavka je bila potrjena v delu M.A. Bakay et al. (1999). Izkazalo se je, da so bili bolniki z mešano obliko in hudim potekom cistične fibroze bodisi homozigotni za "ničelni" alel gena glutation transferaze M1 (GSTM1 0/0) -

encim druge faze ksenobiotičnega razstrupljanja ali pa je imela počasi izražen S-alel gena prve faze razstrupljanja - mikrosomska epoksihidrolaza (mEPXH).

To delo je tudi opazilo znatno prevlado homozigotnega stanja za alel S (ali S/S) v genu mEPXH pri bolnikih s kroničnimi boleznimi dihal.

Glede na jasno korelacijo pljučne patologije s "počasnim" alelom gena mEPXH in "ničelnim" alelom gena GSTM1 smo ugotovili, da je pri bolnikih s cistično fibrozo povezana z ustrezno porazdelitvijo alelov (mEPXH S/S in GSTM1). ), najpogosteje se razvije pljučna patologija in je še posebej neugodna. Zaradi tega so avtorji menili, da je primerno razjasniti ne le naravo mutacije v genu za cistično fibrozo, temveč tudi določiti pri bolnikih, ki nosijo neugodne alele genov mEPXH S/S in GSTM1. Z drugimi besedami, to delo kaže jasen vpliv nekaterih alelov genov DQA1 lokusa HLA na resnost cistične fibroze in kroničnih bolezni dihal.

Razstrupljanje s citokromom P 450

V membranah ER celic jeter, pa tudi drugih organov in tkiv, obstajajo encimski sistemi monooksidaze, ki zagotavljajo biosintetske in razstrupljevalne procese za nevtralizacijo (pretvorbo) ksenobiotikov (zdravil in umetnih spojin - prokarcinogenih) v prvi fazi. razstrupljanja. Ti sistemi so oblikovani iz hiperdružin citokroma P 450 ali monooksigenaz, ki presnavljajo širok spekter eksogenih in endogenih substratov.

Od januarja 2006 je bilo v genomih ljudi in živali identificiranih 1174 proteinov in ustrezno število genov, ki jih kodirajo, povezanih s citokromi P 450 (Lisitsa A.V., 2007). Poleg tega je bilo znanih 1708 kemičnih spojin, ki medsebojno delujejo z encimi sistema citokroma P 450, vključno s 1223 substrati, 115 induktorji in 484 inhibitorji.

V človeškem telesu je izoliranih približno 50 oblik citokromov P 450 (Helson, 1998), ki sodelujejo v reakciji monooksigenazne katalize in imajo v njej vodilno vlogo zaradi sposobnosti selektivne vezave na substrat. Delovanje citokroma P 450 določa njihova interakcija s partnerskimi proteini. Encimi citokroma P 450 zaprejo transportno verigo elektronov in uporabijo nastale redoks ekvivalente za oksidacijo substrata. Kot

Proteinski partnerji citokroma P 450 so lahko bodisi več proteinov, na primer NADPH-citokrom P 450 reduktaza in citokrom b5, kot tudi adrenodoksin reduktaza in adrenodoksin, ali pa je lahko samo en protein, na primer reduktaza.

Med človeškimi geni, ki kodirajo encime citokroma P 450, je bil izoliran aromatazni gen CYP19, ki je odgovoren za sintezo encima, ki katalizira prehod androgenov v estrogene v različnih tkivih, vključno s tkivom dojke. Ta gen ima 11 polimorfizmov DNA, povezanih s povečano ali zmanjšano ekspresijo (aleli: TTTA 7, TTTA 11, TTTA 12 itd.).

Drugi gen tega sistema, gen CYP1A1, kodira citokrom P 450 1A1, ki presnavlja ogljikovodike iz tobačnega dima in ima prav tako svoje polimorfizme (T623C, A4489G).

Gen CYP17 kodira citokrom P 450 c17alfa. Sodeluje pri biosintezi spolnih steroidov.

Opozoriti je treba, da lokalizacija citokromov P 450 v jetrnih mikrosomih zagotavlja, da prejmejo elektrone iz flavoproteinskega proteina (citokrom P 450 reduktaza), sami citokromi P 450 pa so aktivna oblika hemoproteinskega proteina. V tem primeru stabilnost tega proteina zagotavlja lipidni dvosloj membrane, sestavljen iz fosfatidilholina ali mešanice mikrosomskih fosfolipidov.

Ugotovljeno je bilo, da med interakcijo citokroma P 450 s ksenobiotikom pride do njegove inaktivacije, pri čemer preide iz aktivne oblike citokroma P 420 v neaktivno. Poleg tega lahko to neaktivno obliko pridobimo z inkubacijo izoliranih jetrnih mikrosomov pri 37 °C.

V reakcijah »ksenobiotik-citokrom P 450« vsi ksenobiotiki delujejo bodisi kot eksogeni substrati (rakotvorne snovi, zdravila, aditivi za živila, toksini, strupi) bodisi kot endogeni substrati (maščobne kisline, prostaglandini, steroidi, holesterol). Molekule teh substratov se vežejo na molekule citokroma P 450 v membranah ER, kar povzroči verigo reakcij lipidne peroksidacije in druge spremembe. Hkrati lahko delujejo neposredno in posredno. V drugem primeru med njimi ločimo obvezne in fakultativne ksenobiotike.

Obvezni ksenobiotiki, na primer fenobarbital, imajo neposreden toksični učinek na hepatocite (učinek je odvisen od odmerka), kar vodi v hepatomegalijo zaradi indukcije jetrnih encimov.

Po drugi strani pa ksenobiotik kortizon povzroči zamaščenost jeter ali steatozo s pretvorbo v zelo strupene intermediate, kot so salicilati in policiklični ogljikovodiki.

Poleg tega neposreden učinek obligatnih ksenobiotikov ali njihovih presnovkov povzroči motnje presnove bilirubina (v vseh fazah njegove sinteze od hema do izločanja v žolčne kanale), dilatacijo sinusoidov in okluzijo jetrnih ven, kar vodi do nekroze in manj pogosto apoptoza jetrnih celic.

Fakultativni ksenobiotiki povzročajo imunsko posredovane reakcije, ki so v osnovi idiosinkrazije ali intolerance na spojine, kot so alergijske reakcije na zdravila.

Sama molekula citokroma P 450 je poškodovana zaradi dveh mehanizmov poškodbe: same beljakovine s prostimi radikali in lipidnega okolja beljakovine v membrani.

Na splošno mehanizem razstrupljanja ksenobiotikov v jetrih s sodelovanjem citokroma P 450 vključuje tri faze.

Prva faza- stik ksenobiotika z encimi ER (mikrosomska frakcija hepatocitov), ​​monooksigenazami, citokrom c-reduktazami, reduciranim NADP (kot kofaktorjem) in citokromom P 450. Pri stiku pride do modifikacije ksenobiotika s tvorbo (sproščanjem) funkcionalnih skupine.

Druga faza- biotransformacija ali konjugacija (kombinacija) ksenobiotične molekule z endogenimi molekulami s sodelovanjem dveh encimov: UDP-glukuroniltransferaze in glutation-S-transferaze, ki zagotavljajo razstrupljanje ali zmanjšanje toksičnosti s pospešenim izločanjem ksenobiotika (glej spodaj). V tej fazi je mikrosomska glutation-transferaza neposredno povezana z molekulo citokroma P 450, kar prispeva k hitri inaktivaciji vmesnih presnovnih produktov ali reakcijskih metabolitov ksenobiotika.

Tretja faza- aktivni transport in izločanje (evakuacija) ksenobiotičnih produktov, transformiranih s pomočjo citokroma P 450 z žolčem in urinom.

Tako je inaktivacija citokroma P 450 pokazatelj poškodbe membran ER v jetrih. Hkrati lahko s stopnjo inaktivacije citokroma P 450 presojamo obnovo ali popravilo poškodovanih celičnih membran.

Razstrupljanje fosfolipidnih hidroperoksidov

Sistem razstrupljanja fosfolipidnega hidroperoksida (LOOH) vključuje tri od glutationa odvisne encimske komplekse, ki izvajajo dvoelektronsko redukcijo LOOH: glutation peroksidazo, fosfolipid peroksid-glutation peroksidazo in selen vsebujočo glutation transferazo tipa alfa (-SH-S-) oz. kompleks GST. Ti encimski kompleksi so razvrščeni kot antioksidanti - kinolam(enolam), so prisotni v vseh celicah, tkivih in organih, sodelujejo z vitamini E, C in ubikinolom (koencim Q) ter so univerzalni sistemi za vezavo aktivnih presnovkov. Vsi trije od glutationa odvisni antioksidativni sistemi spadajo v encimski redoks sistem glutationa(FRSG), ki sodeluje pri LPO in proliferaciji imunokompetentnih celic. GFSH nadzoruje delitev in aktivnost prooksidantov, zavira proste radikalske stopnje peroksidacije, uničuje (neradikalske) perokside in sodeluje z neperoksidnimi produkti peroksidacije.

Lastnosti redoks sistema so določene s stanjem ravnotežja: "oksidacija-redukcija" (glej poglavje 9).

Stopnja aktivnosti od glutationa odvisnih encimov v različnih celicah in tkivih odraža stanje celotnega antioksidativnega sistema, saj so ti encimi potrebni za zaščito pred agresijo ROS, verižnimi reakcijami prostih radikalov in intenziviranjem procesov.

Za indukcijo od glutationa odvisnih encimov je značilna "redundanca" njihove aktivnosti in ravnovesje glede na oksigenacijo celic, tkiv in organov.

Posebna vloga pripada kompleksu GST, ki vključuje 21 encimov, od tega 16 pravih citosolnih, ki so razvrščeni v 6 poddružin (razredov): alfa, mu, omega, pi, theta in zeta. Vsak razred je dimer, sestavljen iz dveh enakih ali različnih podenot (z lastnimi aktivnimi mesti), ki delujeta neodvisno druga od druge. Vsaka podenota ima 2 domeni, povezani s kratko povezovalno verigo 6 aminokislinskih ostankov.

Vsak od šestih razredov encimov je kodiran z genskimi skupinami.

Alfa razred- genski grozd se nahaja v lokusu 6p12, vsebuje gene GSTA1, GSTA2, GSTA3, GSTA4 in GSTA5 ter 7 psevdogenov

novo Geni tega razreda sodelujejo pri presnovi bilirubina, hema in steroidnih hormonov. Gena GSTA1 in GSTA2 sta izražena v vseh tkivih. Gen GSTA3 je bil izoliran iz 8-9 tedenske posteljice. Gen GSTA5 ni bil izoliran iz tkiv.

Mu razred- grozd je preslikan v lokus 1p13.3. Vključuje 5 genov: gen GSTM1 (predstavljen s tremi alelnimi različicami: A, B in O; izražen v jetrih in krvnih celicah); gen GSTM2 (samo v mišicah); Geni GSTM3 in GSTM4 (moda in možgani); Gen GSTM5 (pljuča, možgani, srce, testisi), kot tudi 2 psevdogena.

Omega razred- grozd je sestavljen iz dveh genov, preslikanih na lokus 10q25.1. Od teh gen GSTO1 kodira edinstven gospodinjski encim, ki odstrani radikale S-tiola, ki nastanejo kot odziv na oksidativni stres. Drugi gen je GSTO2 (malo raziskan). Transkripti teh genov so široko zastopani v vseh tkivih. Njihov največji izraz je opazen v jetrih, skeletnih mišicah in srcu; minimalno izražanje se pojavi v pljučih, možganih in posteljici.

razred pi- je predstavljen z enim genom GSTP1, preslikanim na lokus 11q13, in psevdogenom GSTPP, preslikanim na lokus 12q13-q14. Gen GSTP1 ima 3 alelne različice, povezane s polimorfizmom nukleotidnih zaporedij v kodonih 105 in 114, povezanih z aktivnimi centri encimov. Ta gen je zaviralec protein kinaz, ki sodelujejo pri celični proliferaciji in apoptozi.

Theta razred- njegova skupina vključuje 2 gena (GSTT1 in GSTT2), preslikana na lokus 22q11.23. Gen GSTT1 obstaja v dveh alelnih različicah (aktivni in ničelni). Gen GSTT2 je bil slabo raziskan.

razred Zeta- je predstavljen z enim genom GSTZ1, preslikanim na lokus 14q24.3. Gen se izraža v jetrnih celicah in v manjši meri v skeletnih mišicah in možganskih celicah. Sodeluje pri izmenjavi fenilalanina in tirozina.

Opozoriti je treba, da encimi kompleksa GST, ki jih sintetizirajo vsi ti genski razredi, delujejo na podlagi številnih mehanizmov, vključno z:

Katalitska inaktivacija ksenobiotika preko njegove povezave z glutationom ali substitucijske poti pri elektrofilnih atomih ogljika (halogen in nitroalkani), dušika (trinitroglicerin), žvepla (tiocianati in disulfiti) in fosforja (metil parationin);

Nekatalitska konjugacija (vezava) s substratom; klasični substrat je 1-kloro-2,4-dinitrobenzen; ta pot je značilna tudi za konjugacijo oksiarenov, alkenskih epoksidov, nitronijevih in karbonijevih ionov ter prostih radikalov;

Redukcija organskih hidroperoksidov (lipidov in DNA hidroksiperoksidov) v alkohole z izražanjem aktivnosti GSH peroksidaze ali reduciranega glutamina;

Izomerizacija prostaglandinov in steroidov;

Sodelovanje pri presnovi drugih eksogenih spojin.

Zmanjšan glutation(GSH) se nanaša na tiole z nizko molekulsko maso, ki prevladujejo v večini proliferirajočih celic. Ta tripeptid (L-gama-glutamil-L-cisteinilglicin) sodeluje v glutamilnem ciklu in nevtralizira različne toksične spojine tako, da jih pretvori v tioestre (ta napada dušikove, kisikove, žveplove in ogljikove atome). Med nadaljnjo presnovo se konjugati glutationa pretvorijo v merkapturne kisline (merkaptane) in izločijo iz telesa (s hitrostjo približno 0,1 mmol na dan).

Pomen GSH lahko zasledimo pri bolnikih z rakom, pri katerih je koncentracija prostega glutamina odvisna od lastnosti citostatikov, ki osiromašijo njegovo zalogo in povzročijo lizo tumorskih celic. Poleg tega je med celično proliferacijo in rastjo tumorja zmanjšanje koncentracije tiolov in disulfitov odvisno od vzdrževanja ravnovesja presnove, sinteze encimov, odvisnih od glutationa, in odstranitve fosfolipidnih hidroperoksidov.

Razstrupljanje LOOH poteka po shemah, ki vključujejo:

S peroksidom-Ca 2+ stimulirana PLA 2 in glutation peroksidaza po poti "hidroliza-redukcija-popravilo";

PL-peroksid-glutation-peroksidaze in fosfolipaze A 2 po poti "redukcija-hidroliza-popravilo".

Obe shemi vodita do reacilacije lizofosfolipidov.

Hkrati lahko v pogojih neravnovesja med endogenimi oksidanti in antioksidanti pride do presežka ROS in posledičnega oksidativnega stresa. Mehanizem takšnega stresa, imenovan »signalizacija oksidativnega stresa«, spremlja reakcije LPO kot odziv na nevarno visoke ali nizke ravni oksidantov.

Signalizacija oksidativnega stresa

S pomočjo signalizacije oksidativnega stresa (OSS) celica proizvede presežek antioksidantov in aktivira enega ali več razredov encimov: reducirani glutation (glej zgoraj), hem oksigenazo-1, glutation peroksidazo, katalazo, SOD in feritin.

Dokazano je, da OCC spodbuja izražanje genov, ki nadzorujejo apoptozo, citoprotekcijo in druge celične učinke.

OCC vključuje protein kinazo C (PK C), MAPK, hidrolaze, pa tudi fosfolipaze C (PL C) in A 2 (PLA 2), ki jih aktivirajo ioni Ca 2 +. Zgodnji mediatorji teh encimov so LOOH (glej zgoraj), ki veljajo za "mimetike" učinkov rastnih faktorjev (TNF-alfa), citokinov in drugih agonistov, kar kaže na vlogo oksidativnih derivatov kot sekundarnih prenašalcev sporočil (glej poglavje 8).

Na primer, oksidativna aktivacija fosfolipaz s sproščanjem arahidonske kisline sproži tvorbo eikozanoidnih lipidnih mediatorjev in lizofosfolipidov, ki delujejo kot spojine, ki povzročajo neposredne učinke ali se presnavljajo v PAF in druge efektorje.

Po delovanju oksidantov, ki še posebej poškodujejo celične membrane, je usoda celice dvojna: ali preživetje ali smrt zaradi apoptoze ali nekroze - to je odvisno od resnosti "oksidativnega stresa". Na primer, z uporabo endo ali eksogenih peroksidov lahko sprožimo apoptozo v levkemičnih celicah. Možen mehanizem aktivacije s citosolno fosfolipazo (glej poglavje 9), ki vpliva na arahidonoil fosfolipide, vključuje fosforilacijo encima, katalizirano s PKC, in njegovo translokacijo v membrani (z aktivacijo MAPK). Ta mehanizem je malo odvisen od Ca 2+ in se zato aktivira le pri relativno nizkih ravneh LPO.

Sistem superoksid dismutaze

Encim SOD katalizira reakcijo med dvema superoksidnima radikaloma, da nastane vodikov peroksid (H 2 O 2) in molekularni kisik (O 2). Ta reakcija se imenuje dismutacijske reakcije(glejte poglavji 6 in 9).

Gen SOD 1 je lokaliziran na 21. kromosomu in ta lokalizacija je bila v literaturi večkrat obravnavana pri pojasnjevanju vzrokov in mehanizmov razvoja Downovega sindroma (kot trojni odmerek gena). Vendar to ni potrjeno. Izkazalo se je, da je v mitohondrijih normalnih celic, ki služijo kot vir ATP in ROS, dovoljena

raven slednjih vzdržuje zaščitni encimski sistem, ki ga poleg SOD sestavljajo še citokrom oksidaza, glutation peroksidaza in nekateri drugi encimi.

Antioksidativna vloga krvi

Kot je navedeno v poglavjih 8 in 9, imajo signalni mehanizmi pomembno vlogo pri regulaciji aktivnosti membranskih encimov. Večina teh mehanizmov se izvaja preko krvi, ki ima lastno antioksidativno delovanje in je v neposrednem stiku s strukturnimi komponentami sten krvnih žil, ki jih predstavljajo predvsem endotelne celice.

Uravnavanje encimske aktivnosti s strukturnimi in funkcionalnimi elementi krvi je mogoče prikazati na primeru "tkivnega faktorja" ali transmembranskega glikoproteina, ki ga najdemo pri aterosklerozi v adventitiji krvnih žil in notranji regiji aterosklerotičnega plaka. Ta dejavnik se izraža na membranah monocitov in makrofagov ter sodeluje pri vnetju in destabilizaciji plakov; še posebej je občutljiv na delovanje inhibitorjev, ki jih med signaliziranjem sintetizirajo endotelne celice krvnih žil.

Pomembno je omeniti, da se kisik prenaša po krvi, izvaja se baktericidni učinek fagocitov, premikajo se kovinski ioni spremenljive valence, ki so katalizatorji ali zaviralci oksidacijsko-redukcijskih procesov. Hkrati je kri v določeni meri omejevalni člen v antioksidativnem obrambnem sistemu, saj v primerjavi z znotrajcelično vsebino vsebuje malo visokomolekularnih antioksidantov, kar krepi oksidativne reakcije in ne daje prednosti reduktivnim reakcijam.

Mehanizmi obnove celične membrane

Biokemiki že dolgo domnevajo, da se celične membrane prilagajajo poškodbam. To podpirajo na primer podatki o obnovitvenem delu encimov zaradi reakcij, ki jih izvajajo PC C, MAPK in mitohondrijski ATP-odvisni kalcijevi kanali. Zlasti odpiranje kalcijevih kanalov v mitohondrijskih membranah povzroči njihovo depolarizacijo, kar zmanjša prekomerno kopičenje Ca 2+.

Ta mehanizem spodbuja regeneracijo celic med miokardnim infarktom.

Obnovitev encimske aktivnosti je bila eksperimentalno dokazana in vitro poškodovane mikrosomske membrane v jetrih podgan, ko so jim dodali PC ali mešanico PC in lizoPC. Dodatek teh fosfolipidov je obnovil aktivnost glukoza-6-fosfataze, Ca2+-, Na+-, K+-ATPaze, stearoil-CoA desaturaze, lipaze, UDP-glukuroniltransferaze, fenilalanin hidroksilaze in citokrom b5 reduktaze.

Podobni rezultati so bili pridobljeni za možganske sfingomielinaze, srčno mitohondrijsko beta-hidroksibutirat dehidrogenazo in acetilholinesterazo govejih eritrocitov.

V povezavi s temi podatki je bilo predlagano, da je obnovitev aktivnosti membranskih proteinov s fosfolipidi nespecifična, saj večina encimov ne potrebuje določenih vrst fosfolipidov, zato lahko različne vrste slednjih (ali njihovih mešanic) izvajajo zmanjšanje funkcijo zanje.

Zanimivo je že samo dejstvo sodelovanja membranskih fosfolipidov pri obnavljanju aktivnosti encimskih proteinov. Hkrati je za ohranjanje (in morda ponovno vzpostavitev) aktivnosti membranskih encimov pomembna maščobnokislinska sestava fosfolipidov, dodanih celicam. To se je na primer izkazalo za Ca 2 + -ATPazo sarkoplazemskega retikuluma, ko je zamenjava lastnih fosfolipidov z DPPC (fosfatidilholin z visoko vsebnostjo nasičenih maščobnih kislin) zmanjšala aktivnost za 8-krat v primerjavi z delno delipidiranim encimom in pri zamenjavi lastnih fosfolipidov z dioleil-PC se je hitrost reakcije, nasprotno, močno povečala.

Poleg tega je bil opažen pomen visoke mobilnosti fosfolipidnih ogljikovodikovih verig za obnovo encimske aktivnosti in prisotnost določenega površinskega naboja na membranah.

Podobni rezultati so bili pridobljeni za:

Kisli fosfolipidi (PS, PI in FA) pri njihovem delovanju na laringealno miozin fosfatazo;

Anionski fosfolipidi (PS) - pri delovanju na 5-monodehidrogenazo človeške placente.

Tako lahko trenutno govorimo o neskončni raznolikosti in pomenu še ne odkritih, a očitno dejansko obstoječih mehanizmov za obnovo strukturnih in funkcionalnih poškodb celičnih membran.

Zaviralci mutageneze

Kot je navedeno v 5. poglavju, je mutageneza proces nastanka mutacij v dednem materialu, ki ga povzroči delovanje različnih mutagenih dejavnikov.

Nazaj sredi 20. stoletja. A. Novik in L. Szilard sta pokazala, da apurinski ribonukleozidi zmanjšajo raven spontanih in induciranih mutacij v E. coli, kar jima je omogočilo identifikacijo novega razreda kemičnih spojin, imenovanih antimutageni.

Ob koncu 20. stol. S. de Flora in S. Ramel sta antimutagene razdelila v dva razreda: zunajcelične (dismutagene) in intracelularne.

Zunajcelični antimutageni vključujejo tri podskupine.

Zaviralci absorpcije antimutagenov in njihovih prekurzorjev (aromatske aminokisline, maščobne kisline itd.). Preprečujejo prodiranje in pospešujejo izločanje mutagenov iz telesa.

Zaviralci endogene tvorbe mutagenov (askorbinska kislina, tokoferol, fenoli, fermentirani mlečni izdelki). Preprečujejo ali zavirajo reakcije nitrozacije ali spreminjajo črevesno floro.

Deaktivatorji mutagenov kot posledica fizikalnih in/ali kemičnih reakcij (antioksidanti, snovi, ki vzdržujejo raven pH v bioloških tekočinah in tioli).

Znotrajcelični antimutageni vključujejo tudi tri podskupine.

Modulatorji metabolizma (tioli in fenoli). Pospešijo prenos mutagenov v netarčne celice in sprožijo mehanizem razstrupljanja.

Inaktivatorji reaktivnih molekul. Medsebojno delujejo z elektrofili, ščitijo nukleofilne regije DNA in ujamejo kisikove radikale.

Modulatorji replikacije in popravljanja DNK (natrijev arzenit, vanilin, inhibitorji proteaz, kumarin, tioli, kobaltov klorid). Povečajo natančnost replikacije, povečajo učinkovitost popravljanja in zavirajo napake pri popravljanju.

Kot izhaja iz te razvrstitve, lahko ista spojina pripada več skupinam, na primer tiolov.

Poleg zunajceličnih in znotrajceličnih antimutagenov je B. Stavrik leta 1992 izoliral več kot 25 antimutagenov ali kemopreventerjev, ki jih vsebujejo, iz različnih vrst živil. Ta skupina vključuje vitamine, maščobne kisline, kalcij, karotido

noide, kumarine, prehranske vlaknine, rastlinske kisline, selen, flavonoide in klorofil.

Antimutageni rastlinskega izvora so zelena paprika, zelje, listi mete, čebula, rastlinska semena in jabolka.

Delovanje antimutagenov je specifično: kaže se z visoko selektivnostjo in je odvisno od odmerka. V tem primeru so lahko nekateri antimutageni zaviralci mutagenov, imajo nasprotni komutageni učinek ali pa se njihov učinek sploh ne pojavi. Takšni antimutageni vključujejo zlasti vitamine C,

Možnosti zaščite celic nekaterih tkiv ob hkratnem povečanju mutagenih učinkov v celicah drugih tkiv ni mogoče izključiti.

Na splošno ostaja vprašanje učinkovitosti eksogenih in endogenih korektorjev mutageneze še vedno odprto.

V zvezi s tem pojdimo k razmisleku o bolj znanih in v znanstveni in izobraževalni literaturi veliko obravnavanih mehanizmih okrevanja v poškodovani celici.

Obnavljanje strukture DNK z uporabo mehanizmov popravljanja

Kot je znano, imajo celice obnovitveno sposobnost oziroma sposobnost, da popravijo in odpravijo (popravijo) poškodbe na molekuli DNK in tako obnovijo njeno prvotno strukturo. Zaradi tega se med procesom replikacije, prepisovanja in prevajanja ohrani le omejeno število mutacij.

Če pa mutacija ni prepoznana, se popačene informacije prepišejo v mRNA in izrazijo v obliki okvarjenega proteina. Posledice takega dogodka za celico so pogosto nepomembne, včasih pa skrajno nezaželene, kar je odvisno od funkcij, ki jih opravlja okvarjeni protein.

Trenutno so številni mehanizmi popravljanja dobro raziskani, tako znani že iz časov klasične genetike (fotoreaktivacija, popravilo timinskih dimerjev; ekscizijsko popravljanje; SOS popravilo) kot tisti, ki so bili odkriti v zadnjih letih (glej spodaj).

Če povzamemo značilnosti teh mehanizmov, lahko sklepamo, da popravilo različnih vrst poškodb v molekuli DNA poteka v več fazah:

Prvi korak- identifikacijo škode in določitev njene vrste;

druga faza- to je aktivacija encimov, ki neposredno spremenijo poškodbo v prvotno stanje ali (če neposredno popravilo ni mogoče) izrežejo poškodovano območje in tvorijo vrzel.

V slednjem primeru sta dodana še dva koraka:

tretja stopnja- to je sinteza novega dela molekule DNA (za zamenjavo poškodovanega);

četrta stopnja- to je vdelava novega odseka v vrzel.

Fotoreaktivacija ali popravilo dimerjev timina

Pod vplivom UV-sevanja lahko v molekuli DNA pride do kovalentnega zamreženja dveh sosednjih pirimidinov (dva timina), ki se nahajata v različnih verigah molekule. V tem primeru nastanejo timinski dimeri (ciklobutanski obroč), ki blokirajo replikacijo DNA. Med popravljanjem timinskih dimerjev se encim, ki jih "prepozna", fotoliaza, združi z njimi in tvori en sam kompleks. UVR aktivira ta encim in ciklobutanski obroč se zlomi, da nastaneta dva ločena timina. A. Kellner je ta mehanizem leta 1949 poimenoval fotoreaktivacija.

Deaminacija (metilacija) in popravilo neujemanja

Kot je navedeno v 6. poglavju, med deaminacija adenin se pretvori v hipoksantin, ki tvori vodikove vezi s citozinom. Gvanin se pretvori v ksantin, ki tvori vodikove vezi s timinom. Timina ni mogoče deaminirati (edina dušikova baza v DNK). Pri presnovi citozina nastane uracil. Če so procesi deaminacije teh dušikovih baz moteni, se v molekuli DNA pojavijo napačne ali nepravilno seznanjene baze. Torej, namesto parov AT nastanejo v verigi DNA pari GT, namesto parov GC pa pari HA - to so napake pri parjenju. Odpravljajo se z uporabo dveh mehanizmov: Popravila GT-neusklajenosti in GA-popravila neujemanja oz. Udeleženci teh mehanizmov odškodnine lahko vključujejo:

Proteinski produkti štirih genov družine Mut: H, L, S in U;

proteini helikaze;

Polimeraze DNA, ki imajo lastnost, da "naredijo korak nazaj", potem ko v rastočo verigo DNK postavijo naslednji nukleotid in izrežejo zadnji nukleotid, če ni komplementaren nukleotidu v vzorčni verigi DNK, tj. sposoben popraviti

ustvarjanje napak pri seznanjanju;

Adenozin trifosfataza (ATP);

Deoksinukleotidne fosfataze (dNTP).

Treba je opozoriti, da mehanizmi popravilo neusklajenosti delujejo na hčerinski verigi in samo v njej zamenjajo nekomplementarne baze.

Kmalu po koncu replikacije encimi metilaze dodajo metilne skupine adeninom v zaporedju GATC (gvanin-adenin-timin-citozin).

Med naslednjo replikacijo postanejo verige DNK razločljive: matična veriga vsebuje metilirane adenine, adenini v hčerinskih verigah pa do konca replikacije še niso metilirani. Njihova metilacija se bo začela šele po koncu replikacije. Čeprav adenini niso metilirani, morajo imeti celice čas, da "popravijo" neskladja. Popravilo neusklajenih baz se lahko pojavi med deaminacijo DNK, ko encim N-glikozilaza prepozna bazo, prekine kovalentno N-glikozidno vez in jo odstrani. Poleg tega lahko med metilacijo DNA pride do popravljanja neujemanja (glejte 7. poglavje).

Če je tvorba klasičnih "Watson-Crick" baznih parov na splošno težavna, lahko med replikacijo pride do napak pri seznanjanju (napak replikacije) in lahko pride tudi do neujemanja. Za njihovo odpravo sodelujejo drugi encimi: najprej endonukleaza pretrga eno verigo DNK na mestih, kjer se pari AT ali GC še niso oblikovali, nato fosfodiesteraza na teh mestih prelomov odcepi tiste sladkorno-fosfatne skupine (AP mesta), do katerih ni podstavki so priloženi. Vrzeli, ki nastanejo v verigi molekul (velikosti enega nukleotida), zapolni DNK polimeraza I, nakar encim ligaza zašije konce DNK in tako vzpostavi prvotno stanje molekule.

Alkilacija in popravilo O6-alkiliranega (metiliranega) gvanina in O4-alkiliranega timina

alkilacija - je adicija alkilnih stranskih skupin (metil, etil, propil ali butil) na purinske ali pirimidinske baze molekule DNK z delovanjem številnih kemičnih mutagenov (alkilirnih sredstev). Na primer, metilnitrozo-gvanit alkilira (metilira) gvanin tako, da mu doda metilno skupino.

Med popravilo O 6 -alkiliranega gvanina(Približno 6 meg) se metilna skupina odcepi od gvanina zaradi kisika, povezanega s šestim atomom, in na tej točki se struktura DNK obnovi. Ta mehanizem je odkril I.A. Rapoport leta 1944

Ugotovljeno je bilo, da se med alkilacijo v celicah sintetizirajo beljakovine - metiltransferaze, ki zajamejo svoje metilne skupine iz modificiranega gvanina in obnovijo prvotno strukturo DNA. Še več, metiltransferaze, ki so zajele takšne skupine, se jih ne morejo več znebiti, kar nakazuje, da ne spadajo v razred encimov, ki se med številnimi reakcijami ne spreminjajo. Poleg tega mehanizma obstaja popravilo O 4 -alkiliranega timina(O 4 -alT). Posledično, če predpostavimo, da so za vsako dejanje neposrednega popravljanja DNK potrebne nove beljakovinske molekule, potem je v primeru poškodbe z alkilirajočimi sredstvi celica prisiljena organizirati njihovo sintezo v razmerju: ena molekula na eno poškodbo. Zato sta procesa nastanka poškodb DNK in njihovega popravljanja med seboj povezana. Običajno se v celici kopiči na tisoče takšnih molekul. Na primer, med enim celičnim ciklom, ki poteka v E. coli 30 minut, se lahko kopiči približno 3000 metiltransferaz, ki lahko nevtralizirajo 3000 poškodb DNK.

Apurinizacija in ekscizijsko popravilo

Apurinizacija - to je tvorba AP mest v nukleotidni verigi

Kot je znano, vsaka somatska celica med delovanjem izgubi približno 10 tisoč purinov in pirimidinov na dan, zaradi česar se v njeni molekuli DNK oblikujejo apurinska mesta ali sladkorno-fosfatne skupine brez baz (AP mesta). Če strani AP ne bi popravili, bi prišlo do katastrofe.

Med eliminacijo AP mest encimi insertaze prekinejo kovalentno N-glikozidno vez med bazo in deoksiribozo, nato pa pride do neposredne vstavitve purinov. Ta mehanizem je leta 1979 odkril T. Lindahl.

Vzroki apurinizacije: povišana temperatura, sprememba pH, ionizirajoče sevanje.

Če se celica ne more spopasti s poškodbami baz in nukleotidov v molekuli DNA z uporabo zgoraj naštetih mehanizmov popravljanja, potem pridejo v poštev kompleksnejši mehanizmi popravljanja, eden izmed njih je popravilo z izrezom,

izvedemo z izrezom (ekscizijo) poškodovane baze v nukleotidu ali bolj razširjenem delu molekule.

Popravilo izrezov Poškodbe baz nastanejo s pomočjo DNA glikozilaz, ki prepoznajo poškodbe baz, ki so posledica metilacije, oksidacije, redukcije, deaminacije, dodajanja formidnih skupin in drugih reakcij.

Družina DNA glikozilaz vključuje 11 vrst encimov, ki se vežejo na substrate ali poškodovane tarče: ura- (vsebuje uracil); hmu-(hidroksimetiluracil); 5-tC-(metilcitozin); Hx-(hipoksantin); 3ntA-, tip I (3-metiladenin) in tip II (vsebuje metiladenin, 7-metilgvanin ali 3-metilgvanin); FaPy-(formidopirimidinski ali 8-hidroksigvaninski ostanki); 5, 6-HT ali endonukleaza III (5,6 hidratirani ostanki timina); PD-(pirimidinski dimeri); neujemanje timina (vsebuje nekomplementarni bazni par GT); substrat mutY (vsebuje nekomplementarni par GA).

Glikozilaze DNA se pritrdijo na lezije in prekinejo glikozidne vezi med modificirano bazo in deoksiribozo, kar povzroči nastanek AP mest.

Nastala AP mesta prepozna encim AP endonukleaza (zmožna prekiniti verigo znotraj molekule DNA ali RNA). Po nastanku preloma začne delovati encim fosfodiesteraza, ki iz DNK odcepi sladkorno fosfatno skupino, na katero baza ni več vezana.

Posledično se v eni verigi DNK pojavi vrzel v velikosti enega nukleotida. Nasproti vrzeli v nasprotni verigi DNK je nedotaknjen nukleotid in drug encim (DNK polimeraza I) vstavi komplementarni nukleotid v vrzel in ga pritrdi na prosti 3" OH-konec. Ta konec verige DNK in 5 Konci, ki so bili predhodno oblikovani, ko je veriga prekinjena, so med seboj povezani pod delovanjem polinukleotidne ligaze. Po tem velja, da je celotna struktura popolnoma obnovljena: nepravilna baza se odstrani, sladkorni fosfat, na katerega je bila baza pritrjena, se izreže, vrzel se zapolni s pravilnim nukleotidom in popravi prelom ene verige.

Ekscizijsko popravilo poškodovanih nukleotidov

Mehanizem za popravilo z izrezom je bolj zapleten in bolj energijsko potraten mehanizem, povezan z izrezovanjem ne le poškodovane baze, temveč pomembnega dela verige.

DNK pred in po poškodbi. Pri Escherichia coli takšno popravilo izvaja večencimski kompleks endonukleaz, ki ga kodirajo trije geni za ultravijolično popravilo ali geni uvr (A, B in C) in se imenuje ekscinukleazni kompleks (slika 50). Ta mehanizem sta opisala R. Setlow in V.N. Soifer leta 1970. Vključuje naslednje stopnje:

Prepoznavanje poškodb z uvr A in B proteini;

Upogibanje molekule DNA in sprememba konformacije proteina uvr B;

Izdelava dveh rezov enoverižne DNA na obeh straneh poškodbe z uporabo uvr proteinov B in C;

Odvijanje DNK v predelu med dvema rezoma s pomočjo proteina uvr D (helikaza II);

Odcepitev fragmenta, ki vsebuje napako dolžine 12 nukleotidov (12-mer) s tvorbo vrzeli, ki porabi energijo ene molekule ATP;

Zapolnitev nastale vrzeli z DNA polimerazo;

Spajanje prostih koncev sladkorno-fosfatnega ogrodja DNA z uporabo DNA ligaze.

Podoben mehanizem obstaja tudi pri ljudeh. Hkrati je njegov ekscinukleazni kompleks sestavljen iz 17 proteinov, ki zapolnjujejo vrzel

riž. 50. Mehanizem popravljanja ekscizije pri E. Coli. (po Elliot W., Elliot D., 2002)

poteka s sodelovanjem DNA polimeraz O&E, odsek, izrezan iz poškodovane verige DNA, pa je dolg 29 nukleotidov (namesto 12 pri E. coli).

Popravilo poškodovanih nukleotidov vključuje popravilo neujemanja ali popravilo nekomplementarnih (nekanoničnih) ali ne-Watson-Crickovih baznih parov - to je tako imenovano popravilo neujemanja (glejte zgoraj).

Popravilo prelomov enoverižne in dvoverižne DNA

Poleg zgoraj obravnavanih mehanizmov popravljanja so mehanizmi za popravljanje enoverižnih prelomov (pretrganja vezi med bazami v eni verigi molekule DNK) in dvoverižnih prelomov (pretrganja vezi med bazami v dveh verigah molekule DNK). znan.

Popravilo zlomov enoverižne DNA

Popravilo prelomov enoverižne DNK - to neposredno odškodnino. Nastane kot odziv na delovanje ionizirajočega sevanja in je zagotovljeno z zaporednim delovanjem encimov: 3"-fosfodiesteraze, DNA polimeraze-b in DNA ligaze (DNA polinukleotidne ligaze). Obnova takega preloma se pojavi z uporabo nedotaknjenega komplementarja DNK veriga kot predloga.

Popravilo zlomov dvoverižne DNA

Dvoverižni prelomi v molekuli DNA so najnevarnejša vrsta poškodbe DNA za celice. Običajno vodijo v razvoj genetske nestabilnosti, pojav točkovnih mutacij in kromosomskih aberacij ter posledično celično smrt.

Znana sta dva mehanizma za popravilo prelomov dvoverižne DNA: nehomologno ponovno spajanje zlomljenih koncev in homologna rekombinacija.

Nehomologno ponovno združevanje zlomljenih koncev DNK

Nehomologna ponovna združitev zlomljenih koncev DNA se zgodi med koncema molekule, ki imajo nehomologna nukleotidna zaporedja različnih dolžin ali zelo kratke homologne regije. Ta popravljalni mehanizem ni nezmotljiv in pogosto služi kot vir točkovnih mutacij, saj je obnovitev prvotne strukture molekule DNA možna le s ponovnim združevanjem koncev iste verige. Če ta pogoj ni izpolnjen, nastanejo kromosomske aberacije: delecije, podvojitve,

inverzije, insercije in translokacije (glej 5. poglavje). Pri sesalcih pride do nehomologne ponovne združitve s sodelovanjem proteina Rad50, sorodnih proteinov, faktorjev Ku, ligaze DNA IV in faktorjev utišanja.

Homologna rekombinacija

Mehanizem homologne rekombinacije so proučevali pri Drosophili melanogaster. Domneva se, da naj bi obstajal v človeških celicah, vendar prepričljivih dokazov za to še ni bilo. Menijo, da med homologno rekombinacijo na eni od verig DNA nastane vrzel, ki je enaka velikosti elementa, odstranjenega iz bakterije (P-element). Popravilo vrzeli poteka s sodelovanjem kopije elementa P, ki se nahaja na sestrski kromatidi in se uporablja kot predloga za sintezo popravil.

Vendar pa lahko med replikacijo nastane enoverižna vrzel nasproti nepopravljenega odseka in te situacije ni mogoče popraviti brez napak brez vpletenosti druge molekule DNA.

Zato ta mehanizem zagotavlja okrevanje le v primerih, ko sta poškodovani obe verigi DNK.

Albertsovi proteini in njihova vloga pri replikaciji in popravljanju DNK

Leta 1968 so odkrili Albertsove proteine ​​ali SSB proteine, ki sodelujejo pri popravljanju DNK. Ti proteini imajo zaradi organizacije svoje terciarne strukture sposobnost elektrostatične vezave na DNA. SSB proteini vsebujejo skupino pozitivno nabitih aminokislinskih ostankov, vendar njihov skupni naboj ostaja negativen, zaradi česar imajo povečano afiniteto za enoverižno DNA.

Če se zaradi motenj v sekundarni strukturi dvoverižne DNA v posameznih verigah njene vijačnice oblikujejo "staljeni odseki", se nanje vežejo Albertsovi proteini, se zlahka usedejo nanje in jih "zravnajo". Hkrati proteini SSB, ki sedijo na komplementarnih verigah molekule, ne dovolijo, da bi se "sesedle", saj imajo zaradi elektrostatičnih interakcij močan negativni naboj, kažejo afiniteto drug do drugega in pokrivajo "staljeno območje" z neprekinjena plast - to stehiometrična količina beljakovin. Z drugimi besedami, ti proteini ne denaturirajo molekule DNA, ampak le popravijo njeno enoverižno stanje.

Sodelovanje SSB proteinov pri replikaciji molekule DNA je za celico absolutno potrebno: ohranjajo obe vzorčni verigi v enoverižnem stanju v replikacijski vilici, ščitijo vsako verigo pred delovanjem nukleaz in selektivno spodbujajo delo DNA. polimeraza (RNA polimeraza ne uporablja enoverižne DNA, prevlečene s SSB).

Tako je vloga SSB proteinov pri popravljanju prelomov eno- in dvoverižne DNA zdaj popolnoma dokazana.

Postreplikacijsko (rekombinacijsko) popravilo DNK

Leta 1968 sta W. Rapp in P. Howard-Flanders odkrila, da bakterije, obdelane z UV žarki poreplikacijsko popravilo ali rekombinacijsko popravilo vzorčne verige DNA, ki je vsebovala veliko nerazrezanih timinskih dimerjev, in v trenutku, ko je DNA polimeraza, ki je vodila replikacijo, dosegla prvi dimer, je na tej točki "zamrznila" za 10 s, nato pa se premaknila izven timinskega dimera (nekako na nerazumljiv način) in nadaljeval sintezo za napako, dokler ni »naletel« na naslednji dimer. Tako so odseki hčerinske verige vsebovali vrzeli (ki se med sintezo DNK niso podvojile), nezaceljene napake pa so ostale v odsekih matrične verige nasproti vrzeli. Sledilo je postreplikacijsko popravljanje poškodovanih območij, pri katerem so sodelovali proteini rec A, ligaze in DNA polimeraze. Ta mehanizem je bil podoben mehanizmu rekombinacije: najprej je bila molekula proteina rec A pritrjena na območje vrzeli, kjer je pod njenim nadzorom prišlo do rekombinacije, med katero je bil del komplementarne verige sestrske verige prenesen v cono vrzeli, tj. med replikativno sintezo je nastala vrzel, ligaza pa je povezala konce novih in starih verig molekul.

SOS popravilo DNK

SOS popravilo DNK je zadnja možnost za DNK celice, ki se je podvojila s poškodbo, ki ni bila popravljena z vsemi zgoraj naštetimi mehanizmi popravljanja. V tem primeru lahko celica odmre, saj lahko replikacija »zastane« ob prvi nepopravljeni poškodbi.

Hkrati pa ima celica za takšne namene zasnovan izjemno tvegan mehanizem, imenovan SOS popravilo DNK. Ta mehanizem sta leta 1953 prvič odkrila J. Wagle in

1974 poimenoval M. Radman W-ponovna aktivacija(sposobnost timinskih dimerjev, da "preživijo" do naslednje replikacije). Med popravljalnim mehanizmom SOS se inducira sinteza proteinov, ki se pritrdijo na kompleks DNA polimeraze in "utrdijo" njeno delo na tak način, da poškodovani kompleks postane sposoben zgraditi hčerinsko verigo DNK nasproti okvarjenih členov verige matriksa, hkrati pa se na hčerinski verigi pojavijo številne napake (mutacije). Posledično je celica na tej stopnji rešena pred smrtjo in lahko doseže mitozo, čeprav bo prišlo do napak in visokega tveganja celične smrti.

Opozoriti je treba, da se zgornji mehanizmi popravljanja molekule DNK nanašajo predvsem na dosežke klasične genetike. Hkrati je bil v zadnjih desetletjih, zahvaljujoč dosežkom mednarodnega znanstvenega programa "Človeški genom" (glej poglavje 1), splošni seznam mehanizmov popravljanja DNK znatno dopolnjen z drugimi prej malo znanimi in novimi mehanizmi.

Popravljanje molekule DNK z uporabo mehanizmov, odkritih v zadnjih letih

Mehanizem popravljanja vključuje encim poli-ADP-riboza polimeraza

Proteinski encim poli-ADP-riboza polimeraza (PARP) je eden od jedrskih dejavnikov, ki prvi prepozna poškodbo DNK. Ta faktor nadzoruje zagon mehanizma popravljanja DNK v živih celicah, začenši z mesta poškodbe DNK, in je del multiproteinskega kompleksa (MP kompleks), ki vključuje tudi faktor XRCC1, DNK ligazo III in beta-DNK polimerazo.

Prisotnost PARP v tem kompleksu zagotavlja usmerjanje vseh udeležencev popravljanja DNK na mesta poškodbe DNK in vivo, kar olajša obnovo molekule DNK.

Faktor XRCC1, ki je del kompleksa MR, se običajno nanaša na "ogrodje", ki posamezno sodeluje z vsako komponento kompleksa kot podporno molekularno strukturo. Ker je bila odkrita poliADP-ribozilacija tega faktorja in vitro, predlagano je bilo, da lahko PARP uravnava aktivnost kompleksa MP s spreminjanjem proteina XRCO in vivo, kar moti njegovo interakcijo z drugimi komponentami kompleksa. To domnevo so podprli podatki, da čezmerna ekspresija faktorja XRCC1 zavira aktivnost PARP in vivo.

Trenutno se ta hipoteza še naprej preučuje; to potrjujejo podatki, da DNA ligaza III, ki je del kompleksa MP, zavira aktivnost PARP in vitro, ko njegova količina presega količino PARP.

Popravljalni model z antirekombinacijskim učinkom encima poli-ADP-riboza polimeraza

V zadnjih letih je bil predlagan model popravljanja DNK z antirekombinacijskim učinkom PARP (Satoh in Lindahl, 1992). V skladu s tem modelom PARP interagira z zlomi DNA in skupaj s poli-ADP-ribozilacijskimi reakcijami sosednjih proteinov specifično ščiti konce DNA pred delovanjem nukleaz in/ali blokira proces rekombinacije. To potrjuje primer poskusnih živali s pomanjkanjem gena PARP. Dokazano je, da odsotnost PARP spodbuja proces rekombinacije in vodi do povečanja incidence nastanka limfoma pri njih. Poleg tega lahko PARP rekrutira faktorje popravljanja DNA s spreminjanjem kromatinskih proteinov.

Popravljanje DNA z uporabo metiltransferaz

S pomočjo podpornih encimov citozin-DNA metiltransferaz (M-taz) je mogoče izvesti de novo metilacijo ostankov citozina v DNA, da nastane 5-metilcitozin (5-mC), kot tudi metilacijo oligonukleotidov, ki vsebujejo napačno sparjene baze. .

Popravljanje DNK z uporabo helikaz

Med encimi, ki sodelujejo pri popravljanju DNK, je veliko pozornosti namenjene skupini DNK helikaz (hilaz). To so filogenetsko stabilni encimi, ki lahko ločijo verige molekule DNA in jo pretvorijo iz naravnega stanja v enoverižno. Helikaze so vključene v vse temeljne genetske procese z ločevanjem starševskih verig molekule DNA ali procese, ki temeljijo na takem ločevanju: replikacija, transkripcija, rekombinacija, popravljanje, segregacija kromosomov, procesiranje in spajanje pre-mRNA, transport mRNA v citoplazmo in njeno prevajanje na ribosome (glej 2. in 3. poglavje). Med temi procesi hilaze omogočijo dostop do enoverižnih odsekov molekule DNA, ki jih odprejo za delovanje drugih encimov. Hilaze se med seboj razlikujejo po smereh delovanja (3" - 5" in 5" - 3") verige DNA, prednostni afiniteti do 3" in 5" konca verige DNA ter afiniteti do kofaktorjev - nukleotidnih trifosfatov. . Ti energijsko odvisni fer-

menti porabijo energijo, ki nastane med hidrolizo nukleotidnih 5"-trifosfatov (običajno ATP) in delujejo v prisotnosti ionov Mg 2 +. Pri izvajanju katerega koli genetskega procesa se hilaze praviloma združujejo v komplekse.

Glede na afiniteto do substrata delimo hilaze v skupine: DNA helikaze, RNA helikaze in helikaze, ki delujejo na hibridnih molekulah RNA/RNA. Prvi so vključeni v začetek transkripcije, rekombinacije, popravljanja in ločevanja kromosomov. Slednji sodelujejo pri biogenezi ribosomov, transkripciji mRNA, spajanju pred mRNA, zorenju in transportu mRNA v citoplazmo ter njenem prevajanju na ribosomih.

Hilaze so razvrščene po aktivnosti (zmožnost gibanja vzdolž molekule DNK, ki jo deli na ločene verige), prisotnosti 7 specifičnih motivov zaporedja aminokislin, ki so neločljivo povezani s celotno družino hilaz, vendar niso potrebni za posamezne. Ti motivi so označeni s številkami: I, Ia, II, III, IV, V in VI (zagotavljajo povezave med hilazami in DNA ter koordinacijo gibanja med katalizo). Čeprav so ti motivi specifični za hilaze, jih najdemo tudi v proteinih, ki uporabljajo nukleotidne trifosfate kot kofaktor (kot hilaze). Mutacije teh motivov povzročijo pomanjkanje aktivnosti hilaze, odvisne od ATP. Skupaj s hilazami so izolirani proteini z motivi, ki nimajo hilazne aktivnosti. Bilo jih je tudi 7, in dobile so ime beljakovinski kandidati za hilaze. Menijo, da bi morali takšni proteini sodelovati tudi pri regulaciji intracelularnih genetskih procesov.

Poleg tega sta bila identificirana 2 mehanizma za gibanje hilaz z različnimi hitrostmi vzdolž nukleotidne verige molekule DNA: model z aktivnim kotaljenjem in model s postopnim drsenjem.

Prvi mehanizem izvaja dimer helikaze DNA, ki v enem ciklu (rotaciji molekule) loči določeno število bp.

Drugi mehanizem izvaja monomer helikaze DNA, ki se premika z določeno hitrostjo.

Število in lastnosti genov, ki kodirajo helikaze v človeškem genomu, niso v celoti določeni, vendar so nekateri geni dobro raziskani. To so geni helikaze, ki pripadajo družini TFIIH in RecQ. Poleg tega je prva družina glavni transkripcijski faktor, sestavljen iz devetih podenot, vključno z dvema hilazama (XPB in XPD), 4 proteini (p62, p52, p44 in p34), kompleksom SAC,

aktivirajočo kinazo (CDK-aktivirajočo kinazo) in 2 ciklina (H in Cdk7).

TFIIH ima od ATP-odvisne aktivnosti helikaze in kinaze, ki ju nadzirata podenoti XPB oziroma XPD. Aktivnost kinaze zagotavlja tudi kompleks SAC.

Pokazalo se je tudi, da TFIIH sodeluje pri popravljanju DNK ("prepozna" odsek DNK dolžine 20-30 bp, ki vsebuje poškodbe, in ga izreže) in služi kot transkripcijski faktor (vzajemno vpliva na regijo promotorja, odvije del DNK dolžine 11-13 bp (n. okoli iniciacijskega mesta transkripcije).

Popravilo nesmiselnih transkriptov mRNA

Približno tretjina dednih bolezni in številne oblike raka nastanejo zaradi nesmiselnih prepisov oz. mutacije premika okvirja(glejte poglavje 5). Kot posledica teh mutacij nastanejo PSC in okvarjeni proteini.

Hkrati pa v celicah obstajajo sistemi, ki prepoznajo in uničijo večino nesmiselnih zapisov. Dva taka (univerzalna za evkarionte) sistema se imenujeta: NMD in SMD (glej 7. poglavje).

Ob zaključku obravnave sistemov za popravilo celične DNK je treba opozoriti, da je obnavljanje napak, ki nastanejo v molekuli DNK kot posledica izpostavljenosti mutagenim dejavnikom, najpomembnejša lastnost vseh živih organizmov.

Med naraščajočim številom mehanizmov popravljanja DNK so tudi mehanizmi preprosto, sproži takoj po poškodbi molekule DNK in kompleks, se sčasoma podaljša in zahteva sintezo številnih encimov. Slednje vključujejo mehanizme, povezane z različnimi stopnjami življenjskega cikla celice, kot tudi shranjevanje celice v vrstnem redu SOS ali vrstnem redu vnosa novih mutacij v molekulo DNA. Vsi obnovitveni mehanizmi imajo skupne patogenetske značilnosti in so tesno povezani s procesi karcinogeneze, mutageneze, teratogeneze in staranja celic in organizmov.

BOLEZNI GENOMA

Bolezni genoma (genetska nestabilnost) so zastopane na vseh področjih molekularne medicine. Od časov klasične genetike so med njimi najbolj znane reparacijske bolezni

V Rusiji v 80-ih in 90-ih letih XX stoletja. Bolezni popravljanja DNK so preučevali pod imenom bolezni genetske (kromosomske) nestabilnosti, kar je ustrezalo njihovi vodilni lastnosti - povečani krhkosti kromosomov.

Trenutno se je obseg teh bolezni znatno razširil. Poleg klasičnih bolezni popravljanja DNA, kot so ataksija-telangiektazija (AT), Fanconijeva anemija (AF), pigmentna kseroderma (XP), Hutchinson-Gilfordova progerija (HG), Bloomov sindrom (BS), spadajo v to skupino bolezni naslednje skupine: razred:

Avtoimunske bolezni: sistemski eritematozni lupus, skleroderma, revmatoidni artritis itd.;

Dedne encimopatije: Knapp-Komrover, Lesch-Nyan, Pendred itd.;

Kromosomski sindromi: Down, Klinefelter, Patau, Shereshevsky-Turner in Edwards; retinoblastom, ki ga povzroča delecija kromosoma 13 (13q14);

Monogene bolezni: Friedreichova ataksija, Darier-Whiteova bolezen, Gardnerjev sindrom, bazalnocelični nevus, Marfan, Rothmund-Thomson, Cornelia de Lange, testikularna feminizacija, fotodermatoza itd.;

Poligene bolezni: psoriaza, sistemska skleroza itd. Genetska nestabilnost se kaže tudi v praktičnem

zdravi nosilci uravnoteženih kromosomskih preureditev, na primer s translokacijo Robertsonovega tipa med kromosomi

Pogosti klinični znaki genomskih bolezni so: izrazite nevrološke manifestacije, krajša pričakovana življenjska doba, simptomi prezgodnjega staranja in povečana pojavnost malignih tumorjev.

Najprej si poglejmo primere klasičnih bolezni genoma ali bolezni popravljanja DNK.

Monogene bolezni, povezane s povečano fotosenzibilnostjo in okvarjenim popravljanjem izrezov DNA

Najbolj znana bolezen tega razreda je PC. Njegova pogostost v populaciji je 1:40-250 tisoč ljudi. PC je prva bolezen Popravilo DNK opisano pri ljudeh. Je heterogen: ima 7 komplementarnih skupin - A, B, C, D, E, F in G. Zlasti

Skupina A je zelo razširjena na Japonskem, kjer predstavlja približno 20 % vseh bolnikov s PC-jem in je povezana z okvaro v postreplikacijskem sistemu popravljanja (ChRta1). Komplementacijski skupini B in C sta pogosti v evropskih državah, skupine D, E, F in G pa v drugih državah sveta.

Gen PC skupine A je lokaliziran na lokusu 9q34.1. Njegov produkt je protein, ki veže DNA in ima dva motiva cinkovega prsta (glejte 8. poglavje).

Gen PC skupine B je preslikan na lokus 2q21; njegov proteinski produkt je helikaza, ki je del transkripcijskega faktorja TFIIH (glej zgoraj).

Gen PC skupine C je preslikan na kromosom 3 in kodira protein p125. Funkcija tega proteina ni bila v celoti ugotovljena, čeprav je znano, da skupaj s proteinom p58 sodeluje pri obnovi popravljalne aktivnosti.

Gen PC skupine D je preslikan na lokus 19q13.2-q13.3; za njegov proteinski produkt (kot produkt gena PC skupine B) je značilna aktivnost helikaze. Menijo, da sta oba genska produkta dve podenoti istega faktorja TFIIH.

Gen PC skupine F je preslikan na lokus 16p13.13; proizvaja endonukleazo, ki reže DNK s 5" strani.

Gen PC skupine G je preslikan na lokus 13q33 in prav tako proizvaja endonukleazo, vendar reže DNK z nasprotne 3" strani.

Glavni simptomi te bolezni so: visoka občutljivost na delovanje ultravijoličnega sevanja, pigmentacija, suhost, razjede in brazgotinjenje kože. Pri bolnikih se razvije rak kože in sluznic (melanom, karcinom).

V vsakem drugem ali tretjem primeru so izraženi nevrološki simptomi (povezani z zgodnjo apoptotično smrtjo nevronov).

V zadnjih letih je bilo ugotovljeno, da se lahko 3 od 7 komplementacijskih skupin PC (skupine B, D in G) manifestirajo kot genokopije druge bolezni popravljanja DNA - Cockaynovega sindroma (CS), ki ga povzročajo napake v endonukleazah ekscizije. sistem za popravilo.

V takih primerih imajo lahko bolniki s PC skupne klinične znake z MC, vključno s povečano občutljivostjo na ultravijolično sevanje. Zato so diagnoze pri takih bolnikih označene kot PKV/SK, PKD/SK, PKG/SK.

Hkrati je SK druga bolezen(po PC), opisano kot bolezen popravljanja ekscizije. Ta sindrom se kaže s pritlikavostjo (pri normalni ravni rastnega hormona), poapnenjem lobanjskih kosti, atrofijo vidnih živcev, gluhostjo in pospešenim staranjem. Pri tem sindromu sta identificirani dve komplementacijski skupini: A in B. Gen CK skupine A je lokaliziran v lokusu 5p12-p14, kodira protein, ki je del transkripcijskega kompleksa TFIIH (glej zgoraj). Gen CK skupine B je lokaliziran v lokusu 10q11.2; kodira protein, ki ima skupna nukleotidna zaporedja s faktorjem, ki nadzoruje transkripcijo in popravilo v E. coli, pri ljudeh pa očitno rekrutira proteine ​​za popravilo izrezov v območje zaustavljenega prepisovanje.

Tretja bolezen Popravilo DNK je trihotnodistrofija (TCD). Pri tej bolezni se preobčutljivost za ultravijolično sevanje kaže pri približno polovici bolnikov.

Bolezen spremlja povečana krhkost las, kar je povezano z zmanjšanjem koncentracije beljakovin, ki vsebujejo žveplo, v njih, ki imajo pomanjkanje cisteina.

Na glavni kompleks simptomov vključujejo: anomalije v razvoju zob in kože, ihtiozo, zapozneli spolni razvoj, telesno in duševno zaostalost, nagnjenost k kožnemu raku.

V številnih primerih je bilo ugotovljeno, da napaka pri popravilu DNK v TCD ustreza napakam pri popravilu, ugotovljenim v vseh skupinah komplementacije PC, razen v skupini B.

Ta korespondenca je še posebej pogosta pri genu PC skupine D. V zvezi s tem se domneva, da je gen PC D polifunkcionalen in njegov proteinski produkt sodeluje pri popravljanju ekscizije in transkripciji, odvisni od RNA polimeraze P. Poleg tega v celicah bolnikov s TCD ne proizvedejo dveh, ampak štiri podenote transkripcijskega faktorja TFIIH.

Četrta bolezen Bloomov sindrom (BS) je povezan s povečano fotosenzitivnostjo in okvarjenim popravljanjem DNA.

Gen SB ali gen BLM (Bloomova mutacija) je preslikan na lokus 15q26 poleg protonkogena fes. Predpostavlja se, da ima ta gen od DNA odvisno aktivnost ATPaze in DNK odvisno helikazo, pri čemer je prva povezana z vzdrževanjem stabilnosti kromosomov v somatskih celicah, druga pa ima ključno vlogo pri popravljanju DNK.

Simptomi SB: sorazmeren pred- in poporodni zaostanek v rasti, hiper- ali hipopigmentacija kože, rdečina na

metuljast obraz, nagnjenost k tumorjem, visoka stopnja spontanih kromosomskih aberacij in SCO.

Monogene bolezni, povezane z zlomi dvoverižne DNA v popolni odsotnosti popravljanja z izrezom

Edini primer bolezni, povezane z zlomi dvoverižne DNA v popolni odsotnosti mehanizmov popravljanja izrezov, je AT ali Louis-Bar sindrom. Bolezen se pojavlja s frekvenco 1:40-100 tisoč ljudi in je značilna cerebelarna ataksija, telangiektazija, imunska pomanjkljivost, visoka krhkost kromosomov in nagnjenost k malignim tumorjem (glej poglavje 5).

V zadnjih treh desetletjih so preučevali številne genetske značilnosti te bolezni. Izkazalo se je, da imajo kromosomi bolnikov z AT skoraj 3-krat skrajšane telomere, ti (kromosomi) so zelo občutljivi na delovanje ionizirajočega sevanja in kemičnih radiomimetikov, kar se kaže v povečanju incidence kromosomskih nepravilnosti (dvojne pretrganje verige) in zmanjšanje preživetja somatskih celic, za katere je značilna radiorezistentna sinteza DNA, ki se kaže v odsotnosti sinteze proteina p53, ki je običajno odgovoren za zakasnitev (ustavitev) mitotičnega cikla pri Stopnji G 1 -S in G 2 -M, potrebni za popravilo poškodbe DNA. Z drugimi besedami, celice bolnikov z AT "preprosto nimajo časa", da bi obnovile normalno strukturo DNK z uporabo mehanizmov popravljanja izrezov. Zato se za odpravo zlomov dvoverižne DNA v takšnih celicah uporabljajo postreplikacijski popravljalni mehanizmi.

Monogene bolezni z okvarjenim popravljanjem ob izrezu, ki ni povezano s fotosenzibilnostjo in zlomi dvoverižne DNA

Bolezni z okvarjenim popravljanjem ob izrezu, ki ni povezano s fotosenzibilnostjo in pretrganji dvoverižne DNA, vključujejo: Fanconijevo anemijo (FA) ter Hutchinson-Gilfordov in Wernerjev progeroidni sindrom.

Fanconijeva anemija

AF je družinska hipoali aplastična anemija s prirojeno pomanjkljivostjo hematopoetskega kalčka kostnega mozga, motnjami pigmentacije kože, teleangiektazijami, bipolarno motnjo in melanomom.

(glejte poglavje 23), nagnjenost k mieloični levkemiji in drugi simptomi.

Stalni znak bolezni je spontana kromosomska nestabilnost, odkrita v celicah kostnega mozga, kože in limfocitov.

FA je heterogena bolezen, ki ima 8 komplementacijskih skupin (A, B, C, D, E, F, G in H), vključno z geni skupin A in C, preslikanimi na lokus 9q22.3, vendar njihovi proteinski produkti niso bili raziskani. dovolj preučeno. Opozoriti je treba, da obstajajo nedoslednosti v podatkih glede odsotnosti povečane fotosenzitivnosti DNK pri bolnikih s FA, čeprav so bili taki podatki že pridobljeni (Higurashi M., Cohen P.E., 1975).

Progerija Hutchinson-Gilford

PCP je redka bolezen (incidenca 1:1 milijon ljudi). Pričakovana življenjska doba bolnikov običajno ne presega 15 let. Gen bolezni ni lokaliziran.

Glavni simptomi: nizka rast, “ptičji profil” obraza, prevlada možganskega dela lobanje nad obraznim delom, venska mreža na lasišču in čelu, suha obrabljena koža, odsotnost obrvi in ​​trepalnic, pogosto popolna alopecija, napake v številu. in oblika zob, popolna odsotnost podkožne maščobe, zapozneli telesni, psihomotorični in duševni razvoj; v urinu - visoka vsebnost hialuronske kisline. Bolniki so običajno neplodni.

Vzroki zgodnje smrti: miokardni infarkt z generalizirano aterosklerozo in fibrozo, maščobna degeneracija možganskega tkiva in parenhimskih organov.

V celicah bolnikov s PRCH so ugotovili napake pri popravljanju navzkrižnih povezav DNA-protein, ki jih povzročajo kemične spojine; močno zmanjšano Hayflickovo število in njegovo povezavo s prirojenim skrajšanjem telomer.

Po analogiji s KS (glej zgoraj) se za otroško progerijo (CP) predpostavlja avtosomno recesivni tip dedovanja, čeprav je možna novonastala avtosomno dominantna mutacija, ki povzroči skrajšanje telomer.

Wernerjev sindrom

Za Wernerjev sindrom (WS) ali progerijo odraslih je značilno prezgodnje staranje, ki se pokaže šele po puberteti. Bolniki zgodaj postanejo sivi in ​​plešasti (do 20 let).

Gen bolezni (gen WRN) je lokaliziran v lokusu 8p12-p21, proizvaja encim helikazo, vendar ni del glavnega transkripcijskega kompleksa TFIIN. Ta značilnost je tisto, kar razlikuje SV od osebnih računalnikov skupine B in D ter SC skupine B, v katerih je aktivnost helikaze neposredno povezana s popravilom, povezanim s transkripcijo.

Glavni simptomi:»starajoča se koža« (hiperpigmentacija, hiperkeratoza, gubanje, suhost, teleangiektazije), nem glas, spremembe notranjih organov, značilne za staranje telesa (ateroskleroza srca in ožilja, siva mrena, osteoporoza, sladkorna bolezen; benigni ali maligni tumorji), v urinu - visoka vsebnost hialuronske kisline. Hayflickovo število je močno omejeno ne samo glede števila delitev, ampak tudi glede trajanja celičnega cikla (3-5 krat nižje od običajnega). Za razliko od situacije s PRCG, pri SV kromosomi bolnikov nimajo skrajšanih telomer.

Onkološke bolezni, povezane z motnjami regeneracije

Od opisa retinoblastoma, ki ga povzroča delecija kromosoma 13 (13q14; glej 17. in 25. poglavje), so se začele intenzivne raziskave o vlogi genskih mutacij pri dednih oblikah raka. Pri mnogih oblikah raka se je izkazalo, da genske mutacije poslabšajo popravilo neujemanja, ki se pojavi kot napaka pri replikaciji (zaradi majhnih izbrisov ali vstavkov). Takšne mutacije so podobne mutaciji v genu mutS v E. coli, kar vodi do napak pri popravljanju neujemanja.

Pri ljudeh je mutacija v eni kopiji gena MSN2 močno povezana z razvojem družinskega nepolipoznega raka debelega črevesa (HNPCC) in raka endometrija. Ugotovljeno je bilo tudi, da je pri teh boleznih v tumorskih celicah odsotna druga kopija gena in opažena je izjemno visoka frekvenca ponovitev mikrosatelitov (100-krat višja od običajne). Poleg tega oblike raka dojke, povezane z genoma BRC1 in BRC2, oblike Alzheimerjeve bolezni, povezane s štirimi geni (PS1-PS4) in genom za prionski protein, ter drugi primeri kopiranja genov številnih monogenskih in poligenskih bolezni pri ljudeh so bili povezani s tumorji (glejte poglavji 17 in 25).

Za ohranitev glavnih značilnosti celice ali organizma skozi vse življenje, pa tudi skozi več generacij, mora biti dedni material odporen na zunanje vplive oziroma morajo obstajati mehanizmi za popravljanje sprememb, ki nastanejo v njem. V živi naravi se uporabljata oba dejavnika. Tretji dejavnik je natančnost kopiranja nukleotidnih zaporedij materine DNK med njeno replikacijo.

riž. 3. 13. Beljakovine, ki sodelujejo v procesu replikacije DNK

DNA helikaza odvija dvojno vijačnico DNA in ločuje njene polinukleotidne verige; destabilizirajoči proteini zravnajo del verige DNA; DNK topoizomeraza prekine fosfodiestrsko vez v eni od polikarbonatnih verig DNK, s čimer se sprosti napetost, ki nastane zaradi odvijanja vijačnice in razhajanja verig v replikacijskih vilicah; RNA primaza sintetizira RNA začetnike za hčerinsko verigo in za vsak Okazakijev fragment; DNA polimeraza izvaja kontinuirano sintezo vodilne verige in sintezo Okazakijevih fragmentov zaostajajoče verige; DNA ligaza zlepi Okazakijeve fragmente po odstranitvi primerja RNA

Molekule DNA po reaktivnosti spadajo v kategorijo kemično inertnih snovi. Znano je, da lahko vlogo snovi dednosti igra ne samo DNK, ampak tudi RNK (nekateri virusi). Domneva se, da je izbira v korist DNK posledica njene manjše reaktivnosti v primerjavi z RNK.

Zgoraj obravnavani mehanizem podvajanja je značilen za izjemno visoko natančnost pri reprodukciji strukture DNK. Ko se DNK podvoji, pride do napak s povprečno frekvenco 1·10 -6 komplementarnih baznih parov.

Pri ohranjanju visoke natančnosti replikacije ima pomembno vlogo predvsem encim DNA polimeraza. Ta encim izbere potrebne nukleotide med nukleozid trifosfati (ATP, TTP, GTP, CTP), ki so prisotni v jedrnem soku, jih natančno pritrdi na vzorčno verigo DNK in jih vključi v rastočo hčerinsko verigo (glej sliko 3.10). Pogostost vključitve nepravilnih nukleotidov na tej stopnji je 1·10 -5 baznih parov.

Takšne napake pri delovanju DNA polimeraze so povezane s pojavom spremenjenih oblik dušikovih baz, ki tvorijo "nezakonite" pare z bazami matične verige. Na primer, spremenjena oblika citozina se namesto gvanina veže vodikove vezi na adenin. Posledično se v rastočo verigo DNK vključi napačen nukleotid. Hiter prehod spremenjene oblike takšne baze v običajno moti njeno vezavo na matriks in pojavi se neparen 3"-OH konec rastoče verige DNA. V tem primeru se mehanizem samopopravljanja izvaja DNK polimeraza (ali njej soroden encim – editing endonukleaza). Samopopravek je sestavljen iz cepitve nukleotida, ki je pomotoma vključen v verigo DNA in ni seznanjen s predlogo (slika 3.14). Posledica samopopravljanja je zmanjšanje stopnje napak za 10-krat (iz 10 -5 na 10 -6).

Kljub učinkovitosti samopopravljanja se po podvajanju DNK odkrijejo napake med replikacijo. To se še posebej pogosto opazi, ko je koncentracija štirih nukleozid trifosfatov v okoliškem substratu motena. Precejšen del sprememb nastane tudi v molekulah DNK kot posledica spontano nastalih procesov, povezanih z izgubo purinskih baz - adenina in gvanina (apurinizacija) - ali deaminacije citozina, ki se pretvori v uracil. Pogostost zadnjih sprememb doseže 100 na 1 genom/dan.

Baze, ki jih vsebuje DNK, lahko spremenijo reaktivne spojine, ki zmotijo ​​njihovo normalno združevanje, pa tudi ultravijolično sevanje, ki lahko povzroči nastanek kovalentne vezi med dvema sosednjima ostankoma timina v DNK (dimeri timina). Te spremembe v naslednjem replikacijskem ciklu bi morale voditi bodisi do izgube baznih parov v hčerinski DNK bodisi do zamenjave nekaterih parov z drugimi. Te spremembe resda spremljajo vsak cikel replikacije DNK, vendar je njihova pogostost veliko manjša, kot bi morala biti. To je razloženo z dejstvom, da se večina tovrstnih sprememb odpravi zaradi delovanja mehanizma odškodnine(molekularna obnova) originalnega nukleotidnega zaporedja DNA.

Mehanizem popravljanja temelji na prisotnosti dveh komplementarnih verig v molekuli DNA. Izkrivljanje nukleotidnega zaporedja v enem od njih zaznajo posebni encimi. Nato se ustrezni del odstrani in nadomesti z novim, sintetiziranim na drugi komplementarni verigi DNA. Ta vrsta odškodnine se imenuje izrez, tiste. z "rezanjem" (slika 3.15). Izvaja se pred naslednjim ciklom replikacije, zato se tudi imenuje predreplikacijski.

riž. 3.14. Shema korekcijskega procesa med sintezo DNK:

jaz-vključitev v verigo DNA nukleotida s spremenjeno (tavtomerno) obliko citoeina, ki se “nezakonito” spari z adeninom; II- hiter prehod citozina v normalno obliko moti njegovo združevanje z adeninom; neparni 3"-OH konec sintetizirane verige preprečuje njeno nadaljnje podaljšanje pod delovanjem DNA polimeraze; III - DNA polimeraza odstrani nezakoniti nukleotid, kar povzroči ponoven pojav tistega, ki je povezan s predlogo 3 "- OH-konec; IV- DNA polimeraza nadaljuje s podaljševanjem verige na 3"-OH koncu

Obnova prvotne strukture DNK zahteva sodelovanje številnih encimov. Pomembna točka pri sprožitvi mehanizma popravljanja je odkrivanje napake v strukturi DNK. Pogosto se takšne napake pojavijo v na novo sintetizirani verigi med procesom replikacije. Encimi za popravilo morajo zaznati to posebno verigo. Pri mnogih vrstah živih organizmov se na novo sintetizirana veriga DNK razlikuje od materinske po stopnji metilacije svojih dušikovih baz, ki zaostaja za sintezo. V tem primeru se nemetilirana veriga popravi. Prelome verige DNK lahko prepoznamo tudi s popravljalnimi encimi. Pri višjih organizmih, kjer sinteza DNK ne poteka kontinuirano, temveč v ločenih replikonih, ima na novo sintetizirana veriga DNK prekinitve, kar omogoča njeno prepoznavo.

Obnova strukture DNK, ko se purinske baze ene od njenih verig izgubijo, vključuje odkrivanje okvare z uporabo encima endonukleaze, ki prekine fosfoestrsko vez na mestu poškodbe verige. Nato spremenjeni del z več sosednjimi nukleotidi odstrani encim eksonukleaza in na njegovem mestu se v skladu z vrstnim redom baz komplementarne verige oblikuje pravilno nukleotidno zaporedje (slika 3.15).

riž. 3.15. Shema ekscizije, predreplikacijsko popravilo DNA

Ko se ena od baz v verigi DNK spremeni, pri obnovi prvotne strukture sodeluje okoli 20 encimov DNK glikozilaz, ki posebej prepoznajo poškodbe, ki nastanejo zaradi deaminacije, alkilacije in drugih strukturnih transformacij baz. Tako spremenjene podlage odstranimo. Pojavijo se območja brez baz in se popravijo, kot pri izgubi purinov. Če se normalna struktura ne vzpostavi, na primer pri deaminaciji dušikovih baz, se nekateri pari komplementarnih baz nadomestijo z drugimi - par C-G se lahko nadomesti s parom T-A itd. (glejte razdelek 3.4.2.3).

Tvorba timinskih dimerjev (T-T) v polinukleotidnih verigah pod vplivom UV žarkov zahteva sodelovanje encimov, ki ne prepoznajo posameznih spremenjenih baz, temveč obsežnejše poškodbe strukture DNA. Proces popravljanja je v tem primeru povezan tudi z odstranitvijo regije, ki nosi dimer, in obnovitvijo normalnega nukleotidnega zaporedja s sintezo na komplementarni verigi DNA.

V primeru, da sistem ekscizijskega popravljanja ne popravi spremembe, ki je nastala na eni verigi DNK, se med replikacijo ta sprememba popravi in ​​postane last obeh verig DNK. To vodi do zamenjave enega para komplementarnih nukleotidov z drugim ali do pojava prelomov (vrzeli) v novo sintetizirani verigi proti spremenjenim odsekom. Obnova normalne strukture DNK se lahko pojavi tudi po replikaciji.

Poreplikacijsko popravilo izvede z rekombinacijo (izmenjavo fragmentov) med dvema na novo nastalima dvojnima vijačnicama DNA. Primer takega postreplikacijskega popravljanja je ponovna vzpostavitev normalne strukture DNA, ko nastanejo dimeri timina (T-T), ko se ne odstranijo spontano pod vplivom vidne svetlobe ( lahka popravila) ali med popravilom pred replikativno ekscizijo.

Zaradi kovalentnih vezi, ki nastanejo med sosednjimi ostanki timina, se ti ne morejo vezati na komplementarne nukleotide. Posledično se v novo sintetizirani verigi DNA pojavijo prekinitve (vrzeli), ki jih prepoznajo popravljalni encimi. Obnovitev celovitosti nove polinukleotidne verige ene od hčerinskih DNK se izvede zaradi rekombinacije z ustrezno normalno starševsko verigo druge hčerinske DNK. Vrzel, ki nastane v matični verigi, se nato zapolni s sintezo na njej komplementarni polinukleotidni verigi (slika 3.16). Manifestacijo takšnega postreplikacijskega popravljanja, ki se izvaja z rekombinacijo med verigama dveh hčerinskih molekul DNA, lahko štejemo za pogosto opaženo izmenjavo materiala med sestrskimi kromatidami (slika 3.17).

riž. 3.16. Shema postreplikacijskega popravljanja DNK:

jaz- pojav dimera timina v eni od verig DNK;

II- nastanek "vrzeli" v novo sintetizirani verigi proti spremenjenemu odseku matične molekule po replikaciji (puščica prikazuje naknadno zapolnitev "vrzeli" z odsekom iz ustrezne verige druge hčerinske molekule DNA);

III- obnovitev celovitosti hčerinske verige zgornje molekule zaradi rekombinacije in v spodnji molekuli zaradi sinteze na komplementarni verigi

riž. 3.17. Interkromatidne izmenjave (označene s puščicami)

Med predreplikacijskim in postreplikacijskim popravljanjem se večina poškodb strukture DNK obnovi. Če pa se v dednem materialu celice pojavi prevelika škoda in se del ne izloči, se aktivira sistem inducibilnih (spodbujenih) popravljalnih encimov (sistem SOS). Ti encimi zapolnijo vrzeli in obnovijo celovitost sintetiziranih polinukleotidnih verig brez strogega upoštevanja načela komplementarnosti. Zato lahko včasih že sami popravljalni procesi služijo kot vir trajnih sprememb v strukturi DNK (mutacije). Ta reakcija velja tudi za sistem SOS.

Če v celici kljub opravljenemu popravilu ostane visoka stopnja poškodbe strukture DNK, so procesi replikacije DNK v njej blokirani. Takšna celica se ne deli, kar pomeni, da nastalih sprememb ne prenese na svoje potomce.

Zaustavitev celičnega cikla zaradi poškodbe DNA v kombinaciji z nezmožnostjo molekularnega popravljanja spremenjenega dednega materiala lahko s sodelovanjem proteina, katerega sintezo nadzira gen p53, vodi do aktivacije procesa samouničenja (apoptoze). ) okvarjene celice, da bi jo odstranili iz telesa.

Tako obsežen nabor različnih popravljalnih encimov nenehno »pregleduje« DNK, iz nje odstranjuje poškodovane predele in pomaga ohranjati stabilnost dednega materiala. Kombinirano delovanje replikacijskih encimov (DNA polimeraza in editing endonukleaza) in popravljalnih encimov zagotavlja dokaj nizko frekvenco napak v molekulah DNA, ki se vzdržuje na ravni 1 × 10 -9 parov spremenjenih nukleotidov na genom. Pri velikosti človeškega genoma, ki je 3 × 10 9 nukleotidnih parov, to pomeni približno 3 napake na podvajajoči se genom. Hkrati je tudi ta raven zadostna za nastanek pomembne genske raznolikosti v obliki genskih mutacij v času obstoja življenja na Zemlji.

pari drugih. Te spremembe resda spremljajo vsak cikel replikacije DNK, vendar je njihova pogostost veliko manjša, kot bi morala biti. To je razloženo z dejstvom, da se večina tovrstnih sprememb odpravi zaradi delovanja mehanizma popravljanja (molekularne obnove) prvotnega nukleotidnega zaporedja DNA.

Mehanizem popravljanja temelji na prisotnosti dveh komplementarnih verig v molekuli DNA. Izkrivljanje nukleotidnega zaporedja v enem od njih zaznajo posebni encimi. Nato se ustrezni del odstrani in nadomesti z novim, sintetiziranim na drugi komplementarni verigi DNA. Tovrstno popravilo imenujemo ekscizijsko popravilo, tj. z "rezanjem" (slika 3.15). Izvaja se pred naslednjim ciklom replikacije, zato se tudi imenuje

predreplikacijski.

riž. 3.14. Shema korekcijskega procesa med sintezo DNA: I - vključitev v verigo DNA nukleotida s spremenjeno (tavtomerno) obliko citoeina, ki se "nezakonito" pari z adeninom; II - hiter prehod

citozin v normalno obliko moti njegovo združevanje z adeninom; neparni 3"-OH konec sintetizirane verige preprečuje njeno nadaljnje podaljšanje pod delovanjem DNA polimeraze; III - DNA polimeraza odstrani nezakonit nukleotid, zaradi česar se ponovno pojavi 3"-OH konec, seznanjen z matriko; IV - DNA polimeraza nadaljuje podaljševanje verige na 3"-OH koncu

Obnova prvotne strukture DNK zahteva sodelovanje številnih encimov. Pomembna točka pri sprožitvi mehanizma popravljanja je odkrivanje napake v strukturi DNK. Pogosto se takšne napake pojavijo v na novo sintetizirani verigi med procesom replikacije. Encimi za popravilo morajo zaznati to posebno verigo. Pri mnogih vrstah živih organizmov se na novo sintetizirana veriga DNK razlikuje od materinske po stopnji metilacije svojih dušikovih baz, ki zaostaja za sintezo. V tem primeru se nemetilirana veriga popravi. Prelome verige DNK lahko prepoznamo tudi s popravljalnimi encimi. Pri višjih organizmih, kjer sinteza DNK ne poteka kontinuirano, temveč v ločenih replikonih, ima na novo sintetizirana veriga DNK prekinitve, kar omogoča njeno prepoznavo.

Obnova strukture DNK, ko se purinske baze ene od njenih verig izgubijo, vključuje odkrivanje okvare z uporabo encima endonukleaze, ki prekine fosfoestrsko vez na mestu poškodbe verige. Nato spremenjeni del z več sosednjimi nukleotidi odstrani encim eksonukleaza in na njegovem mestu se v skladu z vrstnim redom baz komplementarne verige oblikuje pravilno nukleotidno zaporedje (slika 3.15).

riž. 3.15. Shema izrezovanja, predreplikacijsko popravilo DNK Ko se ena od baz v verigi DNK spremeni pri obnovi originalne

struktur sodeluje približno 20 encimov DNA glikozilaz, ki posebej prepoznajo poškodbe, ki jih povzročajo deaminacija, alkilacija in druge strukturne transformacije baz. Tako spremenjene podlage odstranimo. Pojavijo se območja brez baz in se popravijo, kot pri izgubi purinov. Če se normalna struktura ne vzpostavi, na primer pri deaminaciji dušikovih baz, se nekateri pari komplementarnih baz nadomestijo z drugimi - par C-G se lahko nadomesti s parom T-A itd. (glejte razdelek 3.4.2.3).

Tvorba timinskih dimerjev (T-T) v polinukleotidnih verigah pod vplivom UV žarkov zahteva sodelovanje encimov, ki ne prepoznajo posameznih spremenjenih baz, temveč obsežnejše poškodbe strukture DNA. Proces popravljanja je v tem primeru povezan tudi z odstranitvijo regije, ki nosi dimer, in obnovitvijo normalnega nukleotidnega zaporedja s sintezo na komplementarni verigi DNA.

V primeru, da sistem za popravilo izrezov ne popravi spremembe, ki je nastala na eni verigi DNK, pride do fiksacije med replikacijo

to spremembo in postane last obeh verig DNK. To vodi do zamenjave enega para komplementarnih nukleotidov z drugim ali do pojava prelomov (vrzeli) v novo sintetizirani verigi proti spremenjenim odsekom. Obnova normalne strukture DNK se lahko pojavi tudi po replikaciji.

Poreplikacijsko popravilo izvede z rekombinacijo (izmenjavo fragmentov) med dvema na novo nastalima dvojnima vijačnicama DNA. Primer takega postreplikacijskega popravljanja je ponovna vzpostavitev normalne strukture DNA, ko nastanejo dimeri timina (T-T), ko se ne odstranijo spontano pod vplivom vidne svetlobe ( lahka popravila) ali med popravilom pred replikativno ekscizijo.

Zaradi kovalentnih vezi, ki nastanejo med sosednjimi ostanki timina, se ti ne morejo vezati na komplementarne nukleotide. Posledično se v novo sintetizirani verigi DNA pojavijo prekinitve (vrzeli), ki jih prepoznajo popravljalni encimi. Obnovitev celovitosti nove polinukleotidne verige ene od hčerinskih DNK se izvede zaradi rekombinacije z ustrezno normalno starševsko verigo druge hčerinske DNK. Vrzel, ki nastane v matični verigi, se nato zapolni s sintezo na njej komplementarni polinukleotidni verigi (slika 3.16). Manifestacijo takšnega postreplikacijskega popravljanja, ki se izvaja z rekombinacijo med verigama dveh hčerinskih molekul DNA, lahko štejemo za pogosto opaženo izmenjavo materiala med sestrskimi kromatidami (slika 3.17).

riž. 3.16. Shema postreplikativnega popravljanja DNA: I - pojav dimerja timina v eni od verig DNA;

II - nastanek "vrzeli" v novo sintetizirani verigi proti spremenjenemu odseku matične molekule po replikaciji (puščica prikazuje naknadno zapolnitev "vrzeli" z odsekom iz ustrezne verige druge hčerinske molekule DNA);

III - obnovitev celovitosti hčerinske verige zgornje molekule zaradi rekombinacije in v spodnji molekuli zaradi sinteze na komplementarni verigi

riž. 3.17. Interkromatidne izmenjave (označene s puščicami)

Med predreplikacijskim in postreplikacijskim popravljanjem se večina poškodb strukture DNK obnovi. Če pa se v dednem materialu celice pojavi prevelika škoda in se del ne izloči, se aktivira sistem inducibilnih (spodbujenih) popravljalnih encimov (sistem SOS). Ti encimi zapolnijo vrzeli in obnovijo celovitost sintetiziranih polinukleotidnih verig brez strogega upoštevanja načela komplementarnosti. Zato lahko včasih že sami popravljalni procesi služijo kot vir trajnih sprememb v strukturi DNK (mutacije). Ta reakcija velja tudi za sistem SOS.

Če v celici kljub opravljenemu popravilu ostane visoka stopnja poškodbe strukture DNK, so procesi replikacije DNK v njej blokirani. Takšna celica se ne deli, kar pomeni, da nastalih sprememb ne prenese na svoje potomce.

Zaustavitev celičnega cikla zaradi poškodbe DNA v kombinaciji z nezmožnostjo molekularnega popravljanja spremenjenega dednega materiala lahko s sodelovanjem proteina, katerega sintezo nadzira gen p53, vodi do aktivacije procesa samouničenja (apoptoze). ) okvarjene celice, da bi jo odstranili iz telesa.

Tako obsežen nabor različnih popravljalnih encimov nenehno »pregleduje« DNK, iz nje odstranjuje poškodovane predele in pomaga ohranjati stabilnost dednega materiala. Kombinirano delovanje replikacijskih encimov (DNA polimeraza in editing endonukleaza) in popravljalnih encimov zagotavlja dokaj nizko frekvenco napak v molekulah DNA, ki se vzdržuje na ravni 1 × 10-9 parov spremenjenih nukleotidov na genom. Glede na velikost človeškega genoma 3 × 109 nukleotidnih parov to pomeni približno 3 napake na podvajajoči se genom. Hkrati je tudi ta raven zadostna za nastanek pomembne genske raznolikosti v obliki genskih mutacij v času obstoja življenja na Zemlji.

3.4.2.3. Spremembe v nukleotidnih zaporedjih DNA. Genske mutacije

Nepopravljene spremembe v kemijski strukturi genov, ki se reproducirajo v zaporednih replikacijskih ciklih in se kažejo v potomcih v obliki novih variant lastnosti, imenujemo genske mutacije.

Spremembe v strukturi DNK, ki tvori gen, lahko razdelimo v tri skupine. Mutacije prve skupine so zamenjava nekaterih baz z drugimi. Predstavljajo približno 20 % spontano nastalih genskih sprememb. Drugo skupino mutacij povzroča premik v bralnem okviru, ki nastane, ko se spremeni število nukleotidnih parov v genu. Končno tretjo skupino predstavljajo mutacije, povezane s spremembo vrstnega reda nukleotidnih zaporedij v genu (inverzija).

Mutacije po vrsti zamenjave dušikovih baz. Te mutacije se pojavijo zaradi številnih posebnih razlogov. Eden od njih je lahko sprememba strukture baze, ki je že vključena v vijačnico DNK, do katere pride po naključju ali pod vplivom posebnih kemičnih dejavnikov. Če tako spremenjena oblika baze ostane neodkrita s popravljalnimi encimi, potem lahko med naslednjim replikacijskim ciklom nase pritrdi drug nukleotid. Primer je deaminacija citozina, ki se spontano ali pod vplivom dušikove kisline pretvori v uracil (slika 3.18). Nastali uracil, ki ga encim ne opaziDNA glikozilaza,med replikacijo se veže na adenin, ki nato pritrdi timidil nukleotid. Kot rezultat, par C-G se v DNK nadomesti s parom T-A (slika 3.19, I ). Deaminacija metiliranega citozina ga pretvori v timin (glej sliko 3.18). Timidil nukleotid, ki je naravna sestavina DNK, popravljalni encimi ne zaznajo kot spremembe in med naslednjo replikacijo veže adenil nukleotid. Kot rezultat, namesto para C-G par se pojavi tudi v molekuli DNA T-A (slika 3.19, II).

riž. 3.18. Spontana deaminacija citozina

Drugi razlog za zamenjavo baze je lahko napačna vključitev nukleotida, ki nosi kemično spremenjeno obliko baze ali njenega analoga, v sintetizirano verigo DNK. Če encimi za replikacijo in popravljanje te napake ostanejo neodkriti, se spremenjena baza vključi v proces replikacije, kar pogosto privede do zamenjave enega para z drugim. Primer tega je dodatek nukleotida s 5-bromouracilom (5-BU), podobnim timidil nukleotidu, na adenin matične verige med replikacijo. Med kasnejšo replikacijo 5-BU lažje veže gvanin kot adenin. Gvanin med nadaljnjim podvajanjem tvori komplementarni par s citozinom. Posledično se par A-T v molekuli DNA nadomesti s parom G-C (slika 3.20).

riž. 3. 19. Mutacije po vrsti bazne substitucije (deaminacija dušikovih baz v verigi DNA):

I - pretvorba citozina v uracil, zamenjava para C-G s parom T-A;

II - pretvorba metil citozina v timin, zamenjava para C-G s parom T-A

Iz zgornjih primerov je jasno, da se spremembe v strukturi molekule DNA, kot je zamenjava baz, pojavijo bodisi pred ali med procesom replikacije, najprej v eni polinukleotidni verigi. Če se takšne spremembe med popravilom ne popravijo, potem med kasnejšo replikacijo postanejo last obeh verig DNK.

riž. 3.20. Bazne substitucijske mutacije

(vključitev analoga dušikove baze med replikacijo DNA)

Posledica zamenjave enega para komplementarnih nukleotidov z drugim je nastanek novega trojčka v nukleotidnem zaporedju DNK, ki kodira zaporedje aminokislin v peptidni verigi. To morda ne bo vplivalo na strukturo peptida, če je novi trojček "sinonim" prejšnjemu, tj. bo kodiral isto aminokislino. Na primer, aminokislina valin je šifrirana s štirimi trojčki: CAA, CAG, CAT, CAC. Zamenjava tretje baze v katerem koli od teh trojčkov ne bo spremenila njegovega pomena (degeneracija genetske kode).

IN V primeru, da novonastali triplet šifrira drugo aminokislino, se struktura peptidne verige in lastnosti ustreznega proteina spremenijo. Glede na naravo in mesto zamenjave se specifične lastnosti proteina spreminjajo v različni meri. Obstajajo primeri, ko zamenjava le ene aminokisline v peptidu bistveno vpliva na lastnosti proteina, kar se kaže v spremembi kompleksnejših lastnosti. Primer je sprememba lastnosti človeškega hemoglobina, ko anemija srpastih celic (slika 3.21). V takem hemoglobinu (HbS) (za razliko od normalnega HbA) - v verigah p-globina na šestem mestu je glutaminska kislina nadomeščena z valinom. To je posledica zamenjave ene od baz v tripletu, ki kodira glutaminsko kislino (CTT ali TTC). Rezultat je triplet, ki šifrira valin (CAT ali TsAT). V tem primeru se z zamenjavo ene aminokisline v peptidu bistveno spremenijo lastnosti globina, ki je del hemoglobina (zmanjša se njegova sposobnost vezave na O2) in oseba razvije znake srpastocelične anemije.

IN V nekaterih primerih lahko zamenjava ene baze z drugo povzroči pojav enega od nesmiselni tripleti (ATT, ATC, ACT), ki ne šifrirajo nobene aminokisline. Posledica takšne zamenjave bo prekinitev sinteze peptidne verige. Ocenjuje se, da nukleotidne substitucije v enem tripletu povzročijo nastanek sinonimnih trojčkov v 25 % primerov; v 2-3 - nesmiselnih trojčkih, v 70-75% - pojav pravih genskih mutacij.

Tako lahko nastanejo mutacije substitucije baze bodisi kot posledica spontanih sprememb osnovne strukture v eni od verig obstoječe dvojne vijačnice DNK bodisi med replikacijo v novo sintetizirani verigi. Če se te spremembe ne popravijo med postopkom popravila (ali, nasprotno, nastanejo med popravilom), se popravijo v obeh verigah in bodo nato reproducirane v naslednjih ciklih podvajanja. Zato je pomemben vir takšnih mutacij motnja procesov replikacije in popravljanja.

Mutacije premika okvirja. Ta vrsta mutacije predstavlja znaten delež spontanih mutacij. Nastanejo kot posledica izgube ali vstavitve enega ali več parov komplementarnih nukleotidov v nukleotidno zaporedje DNA. Večina proučevanih mutacij, ki povzročajo